根据DNA扩增的目的和检测的标准,可以将PCR仪分为普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR仪,实时荧光定量PCR仪四类。1. 普通PCR仪一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪称作传统PCR仪,也叫普通PCR仪。如果要做不同的退火温度需要多次运行。主要是用于简单的、对目的***退火温度的扩增。该仪器主要应用于科学研究、教学、***临床、检验检疫等机构。2. 梯度PCR仪一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(温度梯度,通常有12种温度梯度)的PCR仪称作梯度PCR仪。因为被扩增的不同DNA片段,其适退火温度是不同的,通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR扩增,就可以筛选出表达量高的适退火温度,进行有效的扩增。用于研究未知DNA退火温度的扩增,这样节约成本的同时也节约了时间。梯度PCR仪在不设置梯度的情况下也可以做普通PCR扩增。主要应用于科研、教学机构。
所谓real-time Q-PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光***,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在 real-time 技术的发展过程中,两个重要的发现起着关键的作用:(1)在90年代早期,TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现,它能降解特异性荧光记探针,因此使得间接的检测PCR产物成为可能。(2)此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和***的商品化发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。
如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号,它可用于定义 样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,因此只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样 品的起始拷贝数。