材料与方法

一、材料

AFP购自上海领潮公司。SP2／0骨0髓瘤细胞(中科院上海细胞库)。8～12周龄Balb／c小鼠(第四军0医大学实验动物中心)。SPF级。

二、方法

1．动物免0疫：将4只8～12周龄Balb／c小鼠随机分为两组，每组2只，分别命名为1号和2号(第yi组)、3号和4号(第二组)。第yi组按常规免0疫方法进行免0疫一…，第二组采用改良的免0疫方法进行免0疫。免0疫前静脉采集少量血液，析出血0清作为后续检测的阴性对照血0清。

第yi组：AFP50ug(50肚1)与等量福氏完全佐剂(Sigma，美国)混合，充分乳化后注入8～12周龄Balb／c小鼠腹腔，2周后用同量抗原加不完全福氏佐剂(Sigma，美国)腹腔***，4周后用同量抗原加不完全福氏佐剂腹腔***，融合前3 d作腹腔***加强免0疫。

由于改良免0疫法只需二次基础免0疫而常规免0疫法则需要2倍于改良法的免0疫次数，所以改良法抗原用量明显少于常规法，从而大大减少了实验成本的消耗。

此外，本实验通过对比两种免0疫方法的细胞融合率及抗0体阳性率，发现改良免0疫法均显著高于常规免0疫法。

经过后续实验，证明改良法免0疫小鼠的杂交瘤细胞经二次克0隆化后，抗0体阳性率可达检测孔的90％以上。杂交瘤细胞体外连续传代培养，并冻存复苏后仍具有分泌AFP—McAb的能力，并经染色体计数结果表明已成功获得一株AFP—McAb细胞株。这表明改良法与常规方法具有同样的有效性和稳定性。

动物免0疫

使用 quickantibody 作为免0疫佐剂，对小鼠腿部肌肉***免0疫，MRJ 重组蛋白( 1 μg /mL) 与免0疫佐剂各200 μL 混匀免0疫 6-8 周龄 BALB / c 小鼠 4 只，每只*** 100 μL。初次免0疫后第 21 天同样的方法进行第二次免0疫，第 35 天尾静脉取少量血做效价检测，间接 ELISA 检测效价滴度高于 1 ∶ 8 000 则进行冲击免0疫，冲击免0疫直接以不加佐剂的 MRJ 蛋白对小鼠冲击免0疫一次，每只 20 μg。冲击免0疫后 96 h 内取脾0脏细胞做细胞融合。

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在McAb的研制过程中，动物免0疫是McAb制备过程中的关键步骤。但是传统动物免0疫方式通常需要二个月左右，不但耗时长，而且抗原消耗的量大、对抗原纯度要求高。本实验试图通过优化传统免0疫小鼠的方法，大大缩短动物免0疫时间并减少了抗原的消耗量，为进一步组装患者肿0瘤***及血0清中AFP水平检测的***盒打下良好的基础，为临床研究、肿0瘤的诊治提供更为有效的_丁．具。