液相色谱柱的安装
1、首先应确认柱和仪器的接头以及管路是否匹配。为减少死体积,进样阀、柱子、检测器之间的连接管路内径尽可能使用内径较小的管线,同时控制进样器、色谱柱和检测器之间连接管线的长度。安装色谱柱之前,确认流路系统中的溶剂是否正常。对分析较复杂的样品建议安装保护柱。
2、为了使色谱柱与仪器系统达佳的连接效果,应尽量使用与色谱柱接口相匹配的螺帽和锥形接头,如原来的接头长期匹配其他类型的色谱柱,建议在连接新色谱柱前应检查匹配情况,避免造成色谱柱的损坏或因色谱柱不匹配造成的漏液。
3、使用PEEK 材料的通用接头,只需用手拧紧不需要特定扳手,使用压力为5000psi;使用温度不得超过100℃。
液相色谱柱性能评价
色谱柱的性能除了与固定相性能有关外,还与填充技术有关。在正常条件下,填料粒度>20μm时,干法填充制备柱较为合适;颗粒<20μm时,湿法填充较为理想。填充方法一般有4种:①高压匀浆法,多用于分析柱和小规模制备柱的填充;②径向加压法,Waters;③轴向加压法,主要用于装填大直径柱;④干法。柱填充的技术性很强,大多数实验室使用已填充好的商品柱。
色谱柱的清洗溶剂
下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序,作为参考:硅胶柱以正已烷(或庚烷)、和依次冲洗,然后再以相反顺序依次冲洗,所有溶剂都必须严格脱水。能洗去残留的强极性杂质,已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、、、(或)依次冲洗,再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液,那么可以省略用水冲洗这一步。能洗去残留的非极性杂质,在()冲洗时重复***100~200μl四氢数次有助于除去强疏水性杂质。四氢与或的混合溶液能除去类脂。有时也***二甲亚砜数次。此外,用、和三(0.1%)梯度洗脱能除去蛋白质污染。
阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗,阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗,除去交换性能强的盐,然后用水、、(除去吸附在固定相表面的有机物)、、水依次冲洗。
保存色谱柱时应将柱内充满或,柱接头要拧紧,防止溶剂挥发干燥。禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
色谱柱使用过程中,如果压力升高,一种可能是烧结滤片被堵塞,这时应更换滤片或将其取出进行清洗;另一种可能是大分子进入柱内,使柱头被污染;如果柱效降低或色谱峰变形,则可能柱头出现塌陷,死体积增大。
在后两种情况发生时,小心拧开柱接头,用洁净小钢将柱头填料取出1~2mm高度(注意把被污染填料取净)再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相(与柱内相同)填满色谱柱,压平,再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善,但是很难***到新柱的水平。
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