拉曼光谱在生物学研究中的应用    

拉曼光谱是研究生物大分子的有力手段，由于水的拉曼光谱很弱、谱图又很简单，故拉曼光谱可以在接近自然状态、活性状态下来研究生物大分子的结构及其变化。

生物大分子的拉曼光谱可以同时得到许多宝贵的信息：

（1）蛋白质二级结构：α-螺旋、β-折叠、无规卷曲及β-回转

（2）蛋白质主链构像：酰胺Ⅰ、Ⅲ，C-C、C-N伸缩振动

（3）蛋白质侧链构像：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的侧链和后二者的构像及存在形式随其微环境的变化

（4）对构像变化敏感的羧基、巯基、S-S、C-S构像变化

（5）生物膜的脂肪酸碳氢链旋转异构现象。

（6）DNA分子结构以及和DNA与其他分子间的作用。

（7）研究脂类和生物膜的相互作用、结构、组分等。

（8）对生物膜中蛋白质与脂质相互作用提供重要信息。

先了解一下激光拉曼光谱

拉曼光谱法是研究化合物分子受光照射后所产生的散射，散射光与入射光能级差和化合物振动频率、转动频率的关系的分析方法。

与红外光谱类似，拉曼光谱是一种振动光谱技术。所不同的是，前者与分子振动时偶极矩变化相关，而拉曼效应则是分子极化率改变的结果，被测量的是非弹性的散射辐。

一定波长的电磁波作用于被研究物质的分子，引起分子相应能级的跃迁，产生分子吸收光谱。引起分子电子能级跃迁的光谱称电子吸收光谱，其波长位于紫外～可见光区，故称紫外－可见光谱。

电子能级跃迁的同时伴有振动能级和转动能级的跃迁。引起分子振动能级跃迁的光谱称振动光谱，振动能级跃迁的同时伴有转动能级的跃迁。拉曼散射光谱是分子的振动－转动光谱。用远红外光波照射分子时，只会引起分子中转动能级的跃迁，得到纯转动光谱。

拉曼光谱的优点在于它的快速，准确，测量时通常不***样品（固体，半固体，液体或气体），样品制备简单甚至不需样品制备。谱带信号通常处在可见或近红外光范围，可以有效地和光纤联用。

这也意味着谱带信号可以从包封在任何对激光透明的介质，如玻璃，塑料内，或将样品溶于水中获得。现代拉曼光谱仪使用简单，分析速度快（几秒到几分钟），性能很可靠。因此，拉曼光谱与其他分析技术联用比其他光谱联用技术从某种意义上说更加简便（可以使用单变量和多变量方法以及校准。

拉曼光谱仪

1. 曾经一度怀疑线性CCD坏掉了，劝老板再买一个，可老板坚持说不可能的，(没可能坏的啦)。事实证明他是对的。

2. 将拉曼光谱从显微镜光路拆下，倒置固定在光学平台上。

3. 仔细观察光路，拆下大部分零件，拆前拍照记下原始位置。Fig. 4

4. 用白胶水粘紧光栅与反射镜。

5. 拆下两块滤光片，用一块反射镜反射回去，微调半透半反镜并用小孔检查光路，让入射光与出射光重合，使反射光透过pinhole,并且在CCD 镜头前看到光栅散射出的长条光斑。

6. 仔细调节Laser diode 后方的三个调整螺丝，同时微调Pinhole的位置（上方两个机米螺丝，下方一个弹性机米螺丝，前方两个紧固螺丝），使透过Pinhole的光强达到大且光路共轴垂直。耐心缓慢旋转每一个旋钮体会光斑的强度与移动趋势。（难的一步）

7. 将外壳从光学平台卸下并封装好，复原。倒置接回显微镜光路，并仔细调两个反射镜的四个旋钮，使光斑在屏幕正***。

8. 安装后，调节显微镜的上方卤灯的明暗，观察到有信号强弱的变化，若没有，拆掉，重复上述步骤 2-7。

9. 观察到明暗，使用标准样品，用长积分时间（20s），观察到拉曼信号。Fig.7（a）

10. 使用软件上的校准功能(Specify calibration peaks)，用polystyrene样品重新校准。

11. 拆下再次做细微调整让信号强。Fig.7（b）