骨sui内皮祖细胞的分离培养

方法:使用密度梯度离

心法汲差速贴壁法联合的方法培养内皮祖细胞,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化，使用Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1双荧光染色、流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD133 表达情况.结果与结论:培养前4 d细胞增殖不明显第5~10天迅速增殖，并可见细胞集落及线状结构形成培养第7天的内皮祖细胞具有吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1的功能流式细胞仪检测体外培养第十天的细胞,CD133+细胞占19.2%,CD34+细胞占28.7%,CD34+ /CD133+细胞占19.1%.说明密度梯度离心法联合差速贴壁法可在体外有效分离培养大鼠骨sui内皮祖细胞.

磁性细胞标记方式

应用MACS技术进行磁性细胞分选重要的一点是高质量的标记。要尽可能地增强阳性细胞的标记，并减弱背景染色。有两种基本的磁性标记方式:直接标记和间接标记。

1、直接磁性细胞标记(Direct magnetic cell labeling)

(磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞)直接标记是快速、***特异的磁性标记方法。目前有多种分选人、小鼠、大鼠以及非人类灵长类细胞的MACS直标微珠可供选用。

2、间接磁性细胞标记(Indirect magnetic cell labeling )

(磁珠结合不需要的细胞,游离于磁场的细胞为所需细胞)间接磁性细胞标记需要联合使用单ke隆或者多ke隆抗ti和MACS间标微珠。未结合抗ti、生物素化抗ti或者荧光素标记抗ti均可作为一抗标记细胞,再使用抗免yi球蛋白微珠、抗生物素或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠作为二抗磁性标记细胞。3%的上层琼脂，每孔加1ml上层琼脂和100ul单细胞悬液(约1000ell/wel)，混匀，室温凝固。几乎针对任何种系任何细胞的任何一种单抗或多抗,均可用于间接标记。间接标记主要在如下情况时选用:当没有直标磁珠时;需要用几种抗ti的混合物同时分选或去除多种类型的细胞;间接标记有放大作用,因此可在磁性分选抗原表达弱的目的细胞时使用;使用自备或者配体的磁珠分选中。( -般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用行更多。)

细胞培养中常见的污染及解决方法

支原体污染

支原体是隐蔽的污染物，不能通过过滤去除。显微镜下没有任何可见的支原体污染迹象，比如细胞病变和浊度或 pH 值变化（即使在严重污染的培养基中），这样就会导致我们产生错误的安全感。而在牛中，支原体是常见的微生物之一。

解决方法：通常的过滤灭菌方法对支原体没有影响。细胞一旦被支原体污染，特别是对重要的细胞系，必须去除支原体，一般的方法有、抗和抗与补体联合。5、CellTrackerTMGreen染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。值得注意的是，支原体很突出的结构特征是没有细胞壁。因此，它对作用于细胞壁的生物合成（如 β-内酰胺类、万古等）完全不敏感，并且通常对多粘菌素、利福平和类具有耐药性。相反，四环素类和大环内酯类对支原体的***作用很强，而氨基糖苷类和氯的***作用较弱。

***污染

***污染后，培养基一般清澈，保持原色。干细bao培养诱导分化干细bao是一类具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞，理论上具有无限分裂能力，在特定条件下，可分化成特定***。细丝可以在显微镜下观察到。，一些***类似于死细胞碎片，但其中许多清晰可见，看起来像珊瑚，比较容易区分。此外，它们会慢慢长出细细的黑色细丝，因为它们生长得比较慢，不像***那样容易被发现，一旦发现培养基被污染，它们将很难存活。

解决方法：一旦被***污染，果断丢弃，然后对细胞房、CO2 培养箱、器皿和培养基进行消毒。