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假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，酶联******盒厂家，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。

　　双抗1体夹心法测抗原的另一注意点是类风1湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗1体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗1体夹心法检测的血1清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗1体和酶标抗1体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的***，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗1体夹心法ELISA***是否受RF的影响，已被列为这类***的一项考核指标（参见6.2）。

　　双抗1体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

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12．水洗

用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色变蓝（或放入碱性水中也可），但要注意流水不能过大，以防切片脱落。

13．分化

将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色，约2秒至数十秒钟。见切片变红，颜色较浅即可。

14．漂洗

切片再放入自来水流水中使其***蓝色。

15．脱水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各5min。

16、复染

用0.5%伊红乙醇液对比染色1-3min。

伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏1木1精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。

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3、染色弱 原因 解决办法 抗1体浓度过低，孵育时间过短 提高抗1体浓度，孵育时间不能少于60分钟 ***超过有效使用期 及时更换*** 操作中，滴加***时缓冲液未沥干，致 使***稀释 每步滴加***前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥） 室温太低，低于15℃ 若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰 箱过夜） 蛋白封闭过度 封闭时间不要超过10分钟 4、染色阴性 原因 解决办法 操作步骤错误 重新试验，设立阳性对照 ***中无抗原 设立阳性对照片，以验证实验结果 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误

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