PCR革新技术-英国TwistDx Inc公司开发恒温扩增RPA

英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)--被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，目前新的等温扩增检测技术。以此为基础的TwistAmp? 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御和农业等领域。

常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的适宜温度在37°C - 42°C之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

据介绍，RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。

RPA不仅可以对扩增产物进行终点检测，还可以对扩增过程进行实时监控，甚至可以通过试纸条(侧流层析试纸条LFD)读取结果。

目前，TwistAmp? ***盒的扩增子长度在500bp以内。不过，经过特别优化的RPA扩增，也可以生成更长的扩增产物，或者减慢扩增速度(便于定量)，甚至在更低的温度下进行反应。

如何提高扩增曲线的可重复性?

A 优化扩增曲线考虑以下因素: 对于低拷贝数模板，不稳定扩增可能是因为达到检测限或者是反应混匀程度不同（未混匀的反应扩增效率不佳）。另外，在低温情况下存贮，重组酶和辅助蛋白在50%甘油情况下形成沉淀,也是可能导致不稳定扩增的原因。所以，20x主要反应mix在室温下解冻并震荡涡旋将使其成为液体，不影响其功能,并且有效提高扩增效率。不稳定扩增也可能是因为master mix量不足，在加入体系前，用户必须保证震荡后20x主要反应组分均一。

RPA是什么？

自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。

英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。以此为基础的TwistAmp? 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御和农业等领域。

重组酶介导等温核酸扩增技术原理

RAA技术 是重组酶介导等温核酸扩增技术（Recombinase Aided Amplification）的简称，是一种利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温条件下（佳温度37℃）进行核酸扩增的技术。具体原理为：重组酶、单链结合蛋白、引物形成复合体扫描双链DNA，在与引物同源的序列处使双链DNA解旋，单链结合蛋白（SSB）防止单链DNA复性，在能量和dNTP存在的情况下，由DNA聚合酶完成链的延伸，5-20分钟就可实现仪器扩增。