恒温快速扩增***盒应在怎样的温度下使用？

标准的ERA扩增***盒经过配制可在37℃-42℃的温度范围内操作。过高的温度会对反应体系产生不利的影响，因为酶会逐渐地失去全部活性。对于RT***盒，我们建议客户在40℃下运行反应，因为逆转录酶在稍高温度下具有更高的活性。

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恒温快速扩增***盒常用酶原料

尿DNA糖基化酶尿DNA糖基化酶(UDG酶)又称尿-N-糖基化酶(UNG酶)，可水解含尿的单链和双链DNA释放出游离尿，而对RNA无活性，与dUTP搭配使用，可建立成PCR防污染体系。其原理如下：在PCR体系中将dTTP部分或全部替换为dUTP后，使得反应生成含有dU碱基的扩增产物，这些扩增产物不同于天然模板，在进入含有UDG酶的反应体系时，可被UDG酶识别并切割尿碱基与糖磷酸骨架间的N-糖基键，而经切割后的DNA链在碱性或高温条件下易于断裂降解，从而失去被当作模板再扩增的能力，因此可防止扩增子污染（如下图）。市面上的UDG酶主要有普通型和热敏型，其中热敏型UDG酶在室温条件下即可催化反应，50℃以上加热可使其灭活，防止其降解后续PCR形成的含dU扩增产物。虽然UDG/dUTP体系具有防污染功能，但在实际测试中还得兼顾PCR的效率和灵敏度。一方面需确保PCR扩增产物掺入足够量的尿碱基，从而可被UDG有效切割；另一方面也需要保证反应体系添加的dUTP不会明显影响PCR效率，因此dTTP和dUTP的佳比例需通过优化确定。

恒温快速扩增***盒常用酶原料有哪些？

逆转录酶逆转录酶又称反转录酶，是一种RNA介导的DNA聚合酶，其反应过程中体现出三种功能为：以RNA作为模板合成互补DNA链 (complementary DNA, cDNA)，形成RNA:cDNA杂交链；发挥RNase H活性，降解RNA:DNA杂交链中的RNA模板；以cDNA作为模板合成第二链DNA，形成双链DNA（如下图）。其中，RNaseH活性是逆转录酶的一个内在特性，可在合成过程中同时切割RNA:cDNA杂合链中的RNA模板，该特性可能降低逆转录效率，因此在实际应用中，常采用人工改造后的低或无RNase H活性的逆转录酶。常用的逆转录酶有AMV和M-MLV，AMV分离自禽类成髓细胞瘤病毒(***ian Myeloblastosis Virus, AMV)，M-MLV逆转录酶分离自莫洛尼氏鼠病毒(Moloney Murine Leukemia Virus, MMLV)，前者热稳定性优于后者，但AMV逆转录酶的RNaseH活性也更强，不利于长片段cDNA合成。市面上多使用经***工程改造过的M-MLV逆转录酶，其热稳定性改进，可在50℃左右工作，同时RNase H活性进一步减弱，提高了其逆转录效率。

恒温扩增***盒操作步骤

提前30分钟将***盒所需组分取出,室温融化。鹿荡混匀。

1).每个干粉反应管加入29.4 uL Abuffer (注意: Abuffer需完全融化混匀,否则会对实验效果产“生影响) ; 1.每个干粉反应管加入29.4 uLAbuffer (注意: Abuffer需完全融化混匀,否则会对实验效果产生影响) ;

2.每个反应管分别加入2 uL上游引物、2 uL下游引物和0.6 μ探针(引物和探针浓度为10 μM ,对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中)