自备材料：

1、细胞计数器

2、细胞冻存管

3、超低温冰箱或液氮

4、超净工作台

操作步骤(仅供参考)：

1、培养细胞至对数生长晚期，显微镜观察其外观、形态、有无污染等，取状态良好的细胞进行冻存操作。如为贴壁生长细胞，用胰蛋白酶消化并用完全培养基终止消化，进行细胞计数；如为悬浮生长细胞，进行细胞计数。

2、500～1000g离心5min，弃上清。

3、加入适量的通用细胞冻存液，重悬细胞，使细胞浓度达到1～10×106/ml，置于冻存管中，密闭、不要拧的太紧，避免弯曲变形。

4、一般遵循1℃/min的速率进行冷冻。亦可采用4℃20min，-20℃30min，-70℃过夜，***后置于液氮罐中长期存储。

存储条件

储存于4℃以下,质量保障期从产品的生产日期起，为期两年。3个月以上没有使用冻存液计划时，尽可能-20℃冷冻保存。为避免重复冻融过程可能导致的冻存液品质下降和性能降低，推荐将产品分装成小管后，再存放于4℃以下或-20℃冰箱冻存。

冻存细胞复苏步骤：

1、 从冰箱中取出冻存的细胞，立即置于37℃水浴槽中快速解冻。

2、 待冻存管中的细胞混合液完全融化后，立即加入1ml细胞培养基于冻存管中与细胞混合，将其中的混合液移至含有约5ml该细胞培养基的离心管中，1000rmp离心5分钟，收集冻存细胞沉淀，移去上清液（注意勿将细胞沉淀倒掉）。

3、 加入适量的新鲜培养基，使用移液管缓缓加入细胞沉淀中，轻柔混匀，将混匀好的细胞移至事先准备好的培养容器中。

4、 镜检观察，待细胞状态***后可进行其他研究或者培养处理。

原位复苏方式：

1、从冰箱取出冻存培养板，立即放入37℃水浴槽中快速解冻。

2、待冻存的细胞悬液完全融化后，轻轻吸去细胞冻存液，按照常规换液操作加入新鲜培养基继续进行培养。

细胞冷冻保存方法

冻存管冻存方式：

1、按照常用方法收集悬浮细胞或贴壁细胞于试管中。

2、按照培养细胞密度和所用细胞冻存管的尺寸计算所需冻存细胞数。（参考：5×105至5×106cells/ml）。

3、取相当于所需细胞数的细胞悬浮液量，置于离心管中，离心收集培养细胞（参考离心条件：1,000~2,000 rpm，4℃，3~5 min）。移去离心管中的上清液。

4、加入适量无血0清细胞冻存液于离心管中，使细胞浓度为5×105至5×106 cells/ml。缓慢混合均匀，制成细胞混合液。

5、将离心管中的细胞混合液分装于已标示的冷冻保存管中建议每管1ml或1.5ml。。

6、直接将含细胞悬液的冻存管放入-80℃冰箱，冷冻保存。