如何用制备色谱柱制备低含量的杂质？

制备色谱柱为ZorbaxSB-C18 9.4*250mm及gilson馏分收集器，色谱仪为Agilent1100或LC-6A。想用其制备面积***化法含量为0.05%左右的杂质，初步提纯后用高分辨的LC-MS进行定性分析。如何设定色谱条件，如，流量、进样量、样品的浓度、切割点的设置、是否要浓缩，要求将95%以上的主峰切除。

（主峰后有二个杂质靠得很近。）

答：

1.制备用的流动相尽量等级高一点，否则流动相中的杂质会影响LC-MS分析。

2.使用馏分收集器时，延迟体积一定要计算准确，检测器的响应时间设到很小，否则都会影响收集的纯度和回收率。制备柱的流速一般与直径的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速为1mL/min，9.4mm制备柱用1*（9.4/4.6）2,大约为4mL/min。进样量设到几个mg应该基本没有过载。进样样品浓度越高越好。假如进样10mg，理论计算0.05%的杂质大约只有5μg，显然浓度太低，尽量是多做几次，合并馏分然后浓缩后做LC-MS分析。

制备色谱之DAC如何次次装出高柱效

动态轴向压缩柱（Dynamic Axial Compression Column，DAC）是工业化制备液相色谱分离的重要组成部分。当用户填装直径50mm以上制备柱时，传统预装柱很难装出高柱效和对称性，另外预装柱使用过程柱头容易塌陷，导致柱效变差，无法满足长期持续纯化生产。DAC在运行过程中，活塞可以提供持续压力，保证很优的填装柱床密度和稳定性，从而长时间保持很佳分离效果。相比于预装柱或弹簧柱，DAC可以轻松填装和拆卸，实现不同填料反复填装和轻松切换。有人说大柱子不用考虑柱效和对称性，只要能分出样品就行。现实是色谱就是靠柱效来分离的，柱效越高，分离越好，载量越大，收率和得率越高。

通常制备色谱方法开发在4.6mm，10mm或20mm的半制备柱，然后放大到DAC50或DAC100, DAC200，DAC300, DA***50, DAC600或DAC800。理论上多大规模的色谱柱都可以实现与分析柱或半制备柱同样的效率，在现实中，设计优良的DAC柱效甚至高于预装柱。只有柱效和对称性类似才能保证了分离方法的线性放大。

色谱柱大小

与气体相比，液体的密度和粘度更高，因此HPLC色谱柱通常较短且较宽。典型尺寸为10或25厘米，φ为0.46。

但是更大的色谱柱也已用于制备规模的应用，比如φ10、20、30的液相制备色谱柱。

恒谱生有各种直径大小的分析、制备液相色谱柱可供选择，柱管由316L不锈钢制成，不锈钢柱内壁多经过抛光，减小管壁效应，提高柱效的同时还能做到平衡时间短，高流速，低背压，缩短分析时间，节约溶剂，降低成本。

另一方面，由于气体密度较小且粘度较低，因此GC中建议使用更长的内径较窄的色谱柱。毛细管柱的长度可以达到几米。

气相色谱（GC）和***液相色谱（HPLC）

工作温度

由于化合物的热不稳定特性，HPLC操作通常在环境温度下进行，比如操作时将液相色谱柱放入恒温箱中使用。而气相色谱柱操作的环境温度并不苛刻。

工作压力

由于液体具有较高的密度和粘度，因此对于常见的分析分离，需要在5000 – 6000 psi范围内的较高压力。UHPLC系统能够在15,000 – 18,000 psi的范围内运行。GC色谱柱中的载气要求在150 – 200 psi范围内的较低压力即可。