如何用制备色谱柱制备低含量的杂质？

制备色谱柱为ZorbaxSB-C18 9.4*250mm及gilson馏分收集器，色谱仪为Agilent1100或LC-6A。想用其制备面积***化法含量为0.05%左右的杂质，初步提纯后用高分辨的LC-MS进行定性分析。如何设定色谱条件，如，流量、进样量、样品的浓度、切割点的设置、是否要浓缩，要求将95%以上的主峰切除。

（主峰后有二个杂质靠得很近。）

答：

1.制备用的流动相尽量等级高一点，否则流动相中的杂质会影响LC-MS分析。

2.使用馏分收集器时，延迟体积一定要计算准确，检测器的响应时间设到很小，否则都会影响收集的纯度和回收率。制备柱的流速一般与直径的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速为1mL/min，9.4mm制备柱用1*（9.4/4.6）2,大约为4mL/min。进样量设到几个mg应该基本没有过载。进样样品浓度越高越好。假如进样10mg，理论计算0.05%的杂质大约只有5μg，显然浓度太低，尽量是多做几次，合并馏分然后浓缩后做LC-MS分析。

备型柱子柱压上升，柱效下降，怎么办？

对高的价值的制备柱来讲，延长柱子寿命是很重要的。一般要注意保护柱子，一般来说，制备柱子一般需要保护柱配套。

下面是可能堵塞柱子的原因：

（1）如果您所分离的样品中杂质较多而您在上样前没有经过过滤（0.45微米），一些颗粒性杂质会积聚在柱头造成柱压升高。

（2）也有可能是因为您所使用的流动向中含有缓冲盐的原因，结晶或发生化学变化而堵塞。可以把柱子冲一冲。

（3）流动相是否符合液相色谱的要求？是否过滤处理？

气相色谱（GC）和***液相色谱（HPLC）

工作温度

由于化合物的热不稳定特性，HPLC操作通常在环境温度下进行，比如操作时将液相色谱柱放入恒温箱中使用。而气相色谱柱操作的环境温度并不苛刻。

工作压力

由于液体具有较高的密度和粘度，因此对于常见的分析分离，需要在5000 – 6000 psi范围内的较高压力。UHPLC系统能够在15,000 – 18,000 psi的范围内运行。GC色谱柱中的载气要求在150 – 200 psi范围内的较低压力即可。