如何用制备色谱柱制备低含量的杂质？

制备色谱柱为ZorbaxSB-C18 9.4*250mm及gilson馏分收集器，色谱仪为Agilent1100或LC-6A。想用其制备面积***化法含量为0.05%左右的杂质，初步提纯后用高分辨的LC-MS进行定性分析。如何设定色谱条件，如，流量、进样量、样品的浓度、切割点的设置、是否要浓缩，要求将95%以上的主峰切除。

（主峰后有二个杂质靠得很近。）

答：

1.制备用的流动相尽量等级高一点，否则流动相中的杂质会影响LC-MS分析。

2.使用馏分收集器时，延迟体积一定要计算准确，检测器的响应时间设到很小，否则都会影响收集的纯度和回收率。制备柱的流速一般与直径的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速为1mL/min，9.4mm制备柱用1*（9.4/4.6）2,大约为4mL/min。进样量设到几个mg应该基本没有过载。进样样品浓度越高越好。假如进样10mg，理论计算0.05%的杂质大约只有5μg，显然浓度太低，尽量是多做几次，合并馏分然后浓缩后做LC-MS分析。

制备色谱之DAC如何次次装出高柱效

动态轴向压缩柱（Dynamic Axial Compression Column，DAC）是工业化制备液相色谱分离的重要组成部分。当用户填装直径50mm以上制备柱时，传统预装柱很难装出高柱效和对称性，另外预装柱使用过程柱头容易塌陷，导致柱效变差，无法满足长期持续纯化生产。DAC在运行过程中，活塞可以提供持续压力，保证很优的填装柱床密度和稳定性，从而长时间保持很佳分离效果。相比于预装柱或弹簧柱，DAC可以轻松填装和拆卸，实现不同填料反复填装和轻松切换。有人说大柱子不用考虑柱效和对称性，只要能分出样品就行。现实是色谱就是靠柱效来分离的，柱效越高，分离越好，载量越大，收率和得率越高。

通常制备色谱方法开发在4.6mm，10mm或20mm的半制备柱，然后放大到DAC50或DAC100, DAC200，DAC300, DA***50, DAC600或DAC800。理论上多大规模的色谱柱都可以实现与分析柱或半制备柱同样的效率，在现实中，设计优良的DAC柱效甚至高于预装柱。只有柱效和对称性类似才能保证了分离方法的线性放大。

工业制备色谱

针对分离纯化需求，开发了硅胶微球的制备方法，对硅胶微球的颗粒度、孔径、孔体积、机械强度、化学稳定性等进行了调控和优化，并且实现了硅胶微球的规模化生产。针对各类样品的特征和分离需求设计并合成了系列新型硅胶键合色谱固定相，并且实现了针对不同样品分离需求的个性化分离材料设计与制备在分离材料的基础上，进行了制备色谱方法开发研究，建立了从分析柱规模的色谱条件优化以及模拟制备方法开发，到中试规模制备柱方法验证，等高放大到工业规模制备柱的制备色谱工艺开发。将发展的新型色谱分离材料和分离方法应用于中药、生物发酵和化学合成的分离纯化制备3，实现了很好的工业化应用。

蛋白质是具有一定构象(空间结构)的生物大分子:其一级结构是形成肽链的氨基酸序列(数目、种类、顺序)，是蛋白质结构的基础;在一级结构水平上，部分肽链发生卷曲和折叠，形成其二级结构，这种卷曲和折叠是靠肽链中的羰基与氨基之间的氢键维持的:在二级结构的基础上，多肽链再盘绕和折叠，形成三维空间形态，即为蛋白质的三级结构:而蛋白质的四级结构是指同一蛋白质中各条肽链之间的相互关系。