如何用制备色谱柱制备低含量的杂质？

制备色谱柱为ZorbaxSB-C18 9.4*250mm及gilson馏分收集器，色谱仪为Agilent1100或LC-6A。想用其制备面积***化法含量为0.05%左右的杂质，初步提纯后用高分辨的LC-MS进行定性分析。如何设定色谱条件，如，流量、进样量、样品的浓度、切割点的设置、是否要浓缩，要求将95%以上的主峰切除。

（主峰后有二个杂质靠得很近。）

答：

1.制备用的流动相尽量等级高一点，否则流动相中的杂质会影响LC-MS分析。

2.使用馏分收集器时，延迟体积一定要计算准确，检测器的响应时间设到很小，否则都会影响收集的纯度和回收率。制备柱的流速一般与直径的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速为1mL/min，9.4mm制备柱用1*（9.4/4.6）2,大约为4mL/min。进样量设到几个mg应该基本没有过载。进样样品浓度越高越好。假如进样10mg，理论计算0.05%的杂质大约只有5μg，显然浓度太低，尽量是多做几次，合并馏分然后浓缩后做LC-MS分析。

制备色谱

制备色谱是以分离出纯物质为目的的色谱系统，分析色谱是以分析出样品组分信息为目的的色谱系统，基于他们目的的不同，制备色谱相对于分析色谱有很多不同特征，不能简单等同。

当我们在实验室中想得到纳克乃至毫克级的纯物质时，稍微改装下分析型色谱系统就能简单轻松的完成，不过，若所需制备的纯品量很大，此时，再用分析型色谱系统分离纯化，可以预见这将是一场“灾难”。

制备色谱常用的色谱模式有低压，中压，高压三种，以应对不同类型和不同纯度要求的样品的分离，同时尽可能减少成本。

制备色谱的填充

填料是工业制备色谱的血脉，填料的选择和利用是非常关键的，目前已有越来越多的产品应用到IPC中。填料的化学性质和物理性质决定了色谱的分离性能和动力学性能。应用于大规模工业化制备色谱中的填料具有如下特殊的要求。　　

1、机械强度高：填料需要承受很大的机械压力，因为填料在IPC使用中，需要经常装卸，机械性能差的填料经受不住反复填充，它们易破碎，产生细颗粒，降低柱渗透性，甚至堵塞滤片，造成流速分布不均匀，影响分离产物的纯度，在系统中产生极高的柱压而无法继续使用引。　　

2、负载量大：在IPC中，填料的负载量越大，则单位体质量填料可处理的原料量就可增加，因而提高了产率。选择合适孔径及孔径分布的填料是获得高负载量的一个关键因素。　　

3、可大量供应，批间的重现性好：制备色谱工艺过程要扩大，必须有可靠的供货源提供大量填料，否则无法实现工业化。填料各批量之间的化学和机械稳定性、孔结构及可重复的比表面积等必须具有高度的重现性，否则难以保证长期、持续、稳定的分离与纯化生产工艺。　　

4、合适的颗粒大小和窄的粒度分布范围：细颗粒可增加塔板数及分辨率，但同时引起装柱困难，需要更高的操作压力。