低温生物***——***分离方法介绍

孢子分离又可分为以下几种方法：

( 1 ）褶上涂抹法：选取新鲜、健壮、未开伞、未裂破的子实体，洗净后用75 %酒精表面灭菌2 分钟，然后连同培养基一起放入接种箱内，经熏蒸消毒12 ～ 24 小时，再按无菌操作技术将接种环在子实体菌褶上涂抹，把涂抹后带孢子的接种环在培养基上划线接种，，后置于25 ～ 28 ℃恒温箱内培养，可得纯***。

( 2 ）孢子印采集法：取灭过菌的载玻片、试纸或黑布，置于新鲜、未开伞或未开裂的子体菌褶的下方。经24 小时后，便落下孢子，形成印痕（即孢子印）。然后，用接种环或玻璃棒蘸取孢子，接种在平面或斜面培养基上，进行恒温培养，可得纯***。

( 3 ）孢子收集器采集法：孢子收集器由玻璃钟罩、培养皿、三角架、搪瓷盘等组成。钟罩下为一搪瓷盘，直径25 厘米左右，盘内先垫衬4～6 层纱布，***放1 副9 厘米直径的培养皿，大盖口朝下，上放小的，口向上。然后，在上面小的培养皿上放1 只铅丝绕成的三角架，再将带孔的玻璃钟罩盖上，顶上罩孔用棉塞塞好，用纱布包好整个孢子收集器，置于高压灭菌锅或蒸笼内灭菌2小时。

孢子收集器灭菌消毒后，放入无菌室或无菌箱内。然后，用小刀割取1 块4～5 厘米大小的子实体，插在收集器内的三角架顶上（若无孢子收集器，也可用培养皿代替）。再置于温度24 ～26 ℃下培养24 小时，培养皿中便可见到白色粉状物，此即为孢子。此时，可将孢子收集器再移至接种箱内，取出培养皿，盖好，并在培养皿内加入10 ～ 20 毫升的无菌水，使孢子散于本中，成为孢子悬浮液。然后，再用无菌打针筒或吸管吸取孢子悬浮液，接种于试管斜面培养基上，每管注2 ～ 3 滴。置于24 ～ 26 ℃温度下培养5 ～ 7 天，培养基上便可长出白色菌落。待菌落直径有0 . 5 厘米时，选健壮的菌落，再移接于另一试管的斜面培养基上培养。当白色菌丝长满试管时，便得纯***。

低温生物***的应用前景及发展趋势

微生物在农业上的作用已逐渐被人们所认识。国际上已有70多个***生产、应用和推广微生物肥料。我国也有250家企业年产约数十万吨微生物肥料应用于生产。这虽与同期化肥产量和用量不能相比，但确已开始在农业生产中发挥作用，取得了一定的经济效益和社会效应，随着相关研究的深入和市场需求的不断扩大，微生物肥料生产已呈现出规模化工业生产模式。

低温生物***——常用***介绍

侧孢芽孢菌

在延迟期， 短芽孢菌为革兰氏染色阴性，菌体呈细长的杆状；在对数生长期，为革兰氏染色阳性，菌体成短而粗的杆状；在静止期，革兰氏染色又转为阴性，菌体成细长的杆状，偶尔也能观察到椭圆形的芽孢。图1是50号菌用1%H2SO4(pH6.8)负染后的电镜照片：菌体杆状、周生鞭毛、大小约0.88μm×2.2μm。

作为非脊椎动物的病原菌，有关研究人员曾报道了这种***的杀线虫能力，由于所报道的这些侧孢短芽孢菌菌株都不产生伴孢晶体，所以这些菌株的杀线虫毒力因子并非来自于具有特征性的伴孢晶体。然而，***irnova TA，et al.分离到了2株能形成大的伴孢晶体的侧孢短芽孢菌菌株，这两株菌显示出很强的杀昆虫能力，研究证实，这种能力与菌体在形成芽孢过程中的伴孢晶体相关。有趣的是，Singer的实验表明，一株侧孢短芽孢菌的杀线活性源于一个热稳定蛋白的毒性。所有这些研究表明，不同侧孢短芽孢菌菌株拥有不同的线虫致病因子。牛秋红研究小组分离到的侧孢短芽孢菌G4菌株具有显著的杀线虫功能，但其并不产生伴孢晶体。从该菌株的发酵液里提取的粗蛋白酶液在12h内能杀掉所有测试线虫并在24h内完全降解。从侧孢短芽孢菌G4菌株中纯化出的丝氨酸胞外蛋白酶可水解多种底物，包括胶原和线虫体壁，具有很强的杀线虫能力，***病理电镜实验证实这种蛋白酶严重***了线虫体壁。而且，蛋白酶将线虫体壁分解成为一些氨基酸或小肽，这些营养物使病原***更好的生长繁殖。该蛋白酶***异源表达的菌株表现出了明显的杀线虫活性，重组蛋白酶在体外对线虫体壁降解，而蛋白酶缺失菌株丧失了大部分的杀线活性，死的线虫在生测中保持了完整的体壁，表明蛋白酶在线虫侵染中起主要作用。

低温生物***——常用***介绍

固氮菌

固氮菌属于***的一科。菌体杆状、卵圆形或球形，无内生芽孢，革兰氏染色阴性。好氧，厌氧，兼性厌氧均有，有机营养型，能固定空气中的氮素。包括固氮菌属、氮单孢菌属、拜耶林克氏菌属和德克斯氏菌属。固氮菌肥料多由固氮菌属的成员制成。氮是植物生长不可缺少的物质，是合成蛋白质的主要来源，固氮菌擅长从空中取氮，它们能把空气中植物无法吸收的氮气转化成氮肥，源源不断地供植物享用。自生固氮微生物是指在土壤中能够利用的是土壤中的腐殖质***进行固氮的微生物，其中，多数是一类叫做自生固氮菌的***。经过两三天的培养，成对的菌体呈“8”字形排列，并且外面有一层厚厚的荚膜。自生固氮菌中，人们应用得较多的是圆褐固氮菌(Azotobocter chroococcum）。圆褐固氮菌具有较强的固氮能力，并且能够分泌生长素，促进植株的生长和果实的发育，因此，将圆褐固氮菌制成菌剂，施用到土壤中，可以提高农作物的产量。

地衣芽孢菌

提高作物抗病、抗寒、抗旱能力；增加土壤养分、改良土壤结构、提高化肥利用率；促使土壤中的有机质分解成腐殖质，刺激作物生长。促进作物生长、成熟、降低成本、增加产量、提高收入；有一定的固氮、解磷、解钾作用。