限制酶的特点

限制酶是识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。

根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子，限制性内切酶可分为两大类，即I类酶和Ⅱ酶。早先从大肠杆1菌中发现的EcoK、EcoB就属于I类酶。

其分子量较大；反应过程中除需Mg2+外，还需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP；在DNA分子上没有特异性的酶解片断，这是I、Ⅱ类酶之间***明显的差异。

Ⅱ类酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。其分子量小于105道尔顿；反应只需Mg2+；重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。

DNA限制性内切酶酶切是一项基于DNA限制性内切酶的***工程技术，其基本原理是利用限制性内切酶对DNA上特定序列的识别，来确定切割位点并实现切割，从而获得所需的特定序列。

生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的***并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶（简称限制酶）。

　　限制性内切酶已有百余种，每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性，酶的活性需Mg+2来激1活。不同的酶也有许多差别：有些酶除需Mg+2外，还需ATP 等其他辅助因子的激1活;切割位点和识别序列间的距离不同;有的内切酶同时具有甲1基化作用。根据这些差别，可将限制性内切酶分为I、II 和III 种类型。II 型限制性内切酶只需要二价镁离子的激1活，酶在其识别序列内切割双链DNA，产生的各种DNA部分片段具有相同的末端结构，而且大多数的II 型酶可提供粘性未端，有利于片段再连接，大部分II 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称之回文结构。如EcoRI 和HindIII 的识别和切口分别为：

　　EcoRI ： G ↓AATT C HindIII ： A↓AGCT T

　　T TCGA↑ A C TTAA↑G

蓝白斑筛选鉴定

　　用于克1隆的酶还须通过额外的质量鉴定――蓝白斑筛选鉴定，以确定经酶过量消化后DNA末端的完整性。该种鉴定方法为：用酶10倍过量消化适当的载体上lacZ***中单一的酶切位点，连接，转化，并涂XGal/IPTG/Amp平板。成功地切割、连接和表达b-galactosidase可以说明克1隆后***是完整的，一个完整的***产生蓝斑，一个不完整的***(例如，降解的DNA末端)产生白斑。在进行蓝白斑鉴定中，所有的限制性内切酶产生的白斑数量不应超过3%。