目前,传统的获得多***转基yin植株的方法包括共转化,再转化W及杂交。但是运 些传统方法的缺点是共转化的两个或多个***的转化效率是不可控的,每个***在目标***组的插入位置也是不一样的,而***分离会导致不稳定的遗传后代。另外再转化W及杂 交都是耗时的过程。
而为了克服运些缺点,具有单个或者多个转录盒子的多***载体应运而生并成功 应用于多个研究,但是运些多***表达载体的应用没有得到广泛的推广应用。因为大部分 的方法需要亚克1隆W至于克1隆所耗时间拉长;没有标签或者报告***与目标***相连,运 样就导致蛋白或者***的鉴定比较困难;另外,某些方法如采用同尾酶构建多***载体的方法受限于可用的酶的数量不多运个问题。所W构建多***载体需要根据研究目的而设计。
微量凯氏(kjeldahl)定氮法
样品与浓1***共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与***作用,变成***氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下:
NH2 CH2 COOH+3H2 SO4 ――2CO2 +3SO2 +4H2O+NH3 (1)
2NH3 +H2 SO4 ――(NH4 )2 SO4 (2)
(NH4 )2 SO4 +2NaOH――2H2 O+Na2 SO4 +2NH3 (3)
反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。
蛋白质测定***
(1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血1清清蛋白(bsa)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血1清清蛋白用H2O 或0.9%N***配制,酪蛋白用0.05NaOH配制。
(2)双缩脲***:称以1.50克***铜(CuSO4?5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNa***H4O6?4H2O),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此***可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。
原子数由m个氨基酸,n条肽链组成的蛋白质分子,至少含有n个—COOH,至少含有n个—NH2,肽键m-n个,O原子m+n个。分子质量设氨基酸的平均相对分子质量为a,含b个二硫键,蛋白质的相对分子质量=ma-18(m-n)-2b***控制***中的核苷酸 6信使RNA中的核苷酸 3蛋白质中氨基酸 1。蛋白质是由C(碳)、H(氢)、O(氧)、N(氮)组成,一般蛋白质可能还会含有P(磷)、S(硫)、Fe(铁)、Zn(锌)、Cu(铜)、B(硼)、Mn(锰)、I(碘)、Mo(钼)等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为:碳50% 氢7% 氧23% 氮16% 硫0~3% 其他微量。
(1)一切蛋白质都含氮元素,且各种蛋白质的含氮量很接近,均为16%;
(2)蛋白质系数:任何生物样品中每1g元氮的存在,就表示大约有100/16=6.25g蛋白质的存在, 6.25常称为蛋白质常数。
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