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作者:友名生物2022/2/2 5:35:00







与DNA不同,RNA一般为单链长分子,不形成双螺旋结构,但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。

RNA的碱基配对规则基本和DNA相同,不过除了A-U、G-C配对外,G-U也可以配对。

在细胞中,根据结构功能的不同,RNA主要分三类,即tRNA(转运RNA),rRNA(核糖体RNA),mRNA(信使RNA)。mRNA是合成蛋白质的模板,内容按照细胞核中的DNA所转录;tRNA是mRNA上碱基序列(即遗传密码子)的识别者和氨基酸的转运者;rRNA是组成核糖体的组分,是蛋白质合成的工作场所。





总RNA的抽提方法:

目前常用的方法是用异硫qing酸胍苯1酚抽提法。


提取步骤:

先用液氮研磨材料,匀浆,加入Trizol***,进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯1仿抽提,离心,分离水相和有机相,收集含有RNA的水相,通过异丙1醇沉淀,获得比较纯的总RNA,用于下一步mRNA的纯化。也可将含有RNA样品的细胞破碎液通过硅胶膜纯化柱纯化。

RNA浓度和纯度判断:

OD260为1时相当于浓度为50 ug/mL;

OD260/0D280值在1.8~ 2.0之间,表示纯度较好;

0D260/OD280值低于1.8,样品有蛋白质或酚污染;

0D260/0D280值大于2.0,提取的RNA可能有降解;

电泳后如果rRNA大小完整,而且28S rRNA和18SrRNA亮度接近2:1、mRNA分布均匀,则认为RNA。






棉花等酚类、多糖类物质较多的植物DNA提取法:

1 取2g新鲜幼嫩的叶片放入研钵中,加入液氮后快速、充分研磨,待成极细的粉末状时迅速转入到50ml离心管中。

2 在50ml离心管中加入10ml冰预冷的提取缓冲液,在涡悬振荡器上充分混匀。

3 于4℃,2700×g离心20分钟,倒去上清液。

4 在沉淀中加入5ml裂解缓冲液,在涡旋振荡器上充分混匀

5 于65℃水浴锅中温育30min。

6 加入5ml氯1仿/异戊1醇(24/1),并上下翻转以充分混合。

7 于4℃,2700×g离心5分钟。

8 转移上层水相至一新的50ml离心管中。

9 重复步骤7-9一次。

10 加入2/3体积的冰预冷的异丙1醇,并上下翻转以充分混合,至-20℃2h。

11 于4℃,1200×g离心10min。

12 在一新管中加入20ml含80%乙醇15mmol/LNaAc溶液,用玻棒将DNA转入该管(如不能直接用玻棒缠出,可离心后倒出上清,再在其中加入20ml含80%乙醇15mmol/LNaAc溶液),放置20min后稍许离心,移走上清并吸出残存乙醇,室温干燥。

13 加入1 0mlTE(10mmol/LTris-HClPH=8 0,1mmol/LEDTA)并加入终浓度为20(g/L的RNaseA,过夜。

14 风干,用50μlTE缓冲液溶解,存于-20℃备用。



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