T4 RNA连接酶

用途：用RNA 3'末端标记；RNA和RNA分子间连接；寡核苷酸的环化；tRNA修饰；5' RACE中寡核苷酸连接到cDNA单链；在蛋白质特***点引入非天然氨基酸。

来源：由大肠杆1菌表达，表达***的来源为T4嗜菌体。

活性定义：37℃30分钟内，催化1 nmol 5'-[P]-(A)12-18成为磷酸酶不能消化的环形产物所需的酶量定义为1个活性单位。

活性检测条件：50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，10μM 5'-[P]-(A)12-18(10μM in 5'-termini)。

纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷1酸酯酶。

酶储存溶液：10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM DTT，50mM KCl，0.1mM EDTA，50%(v/v)glycerol。

Reaction Buffer(10X)：500mM HEPES-NaOH(pH8.0 at 25℃)，100mM MgCl2，100mM DTT。

据研究表明RNA聚合酶拥有现代蛋白质聚合酶的许多特征，它可以进化从而识别出RNA启动子，然后copy RNA。研究意味着，生命进化早期出现的同样的RNA酶也可能表现出如此复杂的生物学特征。

有证据表明，RNA先于DNA和蛋白质出现。例如，***细胞内制造蛋白质的“机器”核糖体就由RNA制造而成。此外，DNA也由RNA组成。由于RNA是一种万1能工具，可以同时发挥蛋白质和DNA的功能，这表明后来进化出现的DNA和蛋白质是一种“升级”，以增强起初由RNA支持的细胞功能。昂劳实验室发现的聚合酶表明，RNA copy在原始生命体内确实可能存在。

制备互补DNA，往往需要先分离从目的***转录来的mRNA.如果该***编码的蛋白质是细胞中的主要蛋白质，则此***的产物是总mRNA的主要组成部分 。就胰岛B细胞而论，此细胞含有高水平胰岛素前体mRNA，后者有时可以沉淀正在翻译的mRNA的核糖核蛋白体，如果用特异结合所表达的蛋白质(抗原)，则可从沉淀的核糖体中分离出胰岛素特异的mRNA，一般特异mRNA只是细胞总mRNA中的次要成分。在这种情况下，不得不以密度梯度离心，按分子量大小把总mRNA分开，然后把分离开的mRNA直接用于试管中表达蛋白质(用家兔网织细胞的溶胞产物或小麦胚芽提取物作为翻译系统的诱导物)再用沉淀或聚酰胺凝胶电泳从许多表达的蛋白中测定出目的蛋白，从而确定表达该蛋白的特异mRNA。

置换合成法。该方法利用链在反转录酶作用下产生的DNA RNA杂交链不用碱变性，而是在dNTP存在下。利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物。在大肠DNA聚合酶工的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点：①非常有效；②直接利用链反应产物，无须进一步处理和纯化；③不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。