





典型的腺病毒载体系统如:穿梭质粒pCA13/腺病毒***组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。pCA13/的HCMV IE启动子-多克1隆位点-SV40 AN(poly A)构成外源***的表达盒,该表达盒的插入使腺病毒E1***缺失,但是保留其两端侧翼序列(左侧的1~3bp的ITR,右侧从3.5kb到末端的维持病毒装配和活力必须的蛋白IX的***),也保留了腺病毒的包装信号
φ(194~358bp);pBHG11则保留了腺病毒***组的绝大部分,但是缺失了包装信号φ、0.5~3.7图距(mu)部分的E1区、77.5~86.2mu的E3区,293细胞是整合有Ad5 E1***的人胚shen细胞系。pBHG11因为缺失包装信号及E1区而不能copy,pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列,但是缺失E1区及腺病毒绝大部分***组,同样不能copy。外源目的***插入pCA13后,与pBHG11共转染,进入293细胞。pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组,同时,293细胞提供E1蛋白,从而包装产生腺病毒颗粒。该病毒的蛋白质外壳同野1生型腺病毒相似,具有同样的感1染力进入靶1细胞的能力,但是***组DNA的E1区被外源目的***取代,即进入靶1细胞后病毒不能copy,但可以表达目的蛋白。
腺病毒是如何构成的
病毒滴度滴定(***培养半数感1染量TCID 50):将分装好的病毒液接种一长满单层Hep-2细胞的96孔板,第yi列每孔加25μl病毒液,作1/lO 稀释,此后依次作倍比稀释,每稀释度接种8孔,***后一列做阴性对照.对照孔和感1染病毒孔均加入100μl维持液,置37℃ 、5%CO2 培养箱中培养。每天观察并记录出现CPE的孔数及具体时间,待细胞病变不再发展后,观察记录结果,用Reed-Muench法计算病毒滴度TCID 50。
***导入细胞常用方法
噬菌体进入宿主***,病毒进入宿主细胞中繁殖就是感1染(infection)。用经人工改造的噬菌体活病毒作载体,以其DNA与目的序列重组后,在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒,就能以infection的方式进入宿主***或细胞,使目的序列得以copy繁殖。infection的效率很高,但DNA包装成噬菌体或病毒的操作较麻烦。
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