典型的腺病毒载体系统如:穿梭质粒pCA13/腺病毒***组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。pCA13/的HCMV IE启动子-多克1隆位点-SV40 AN(poly A)构成外源***的表达盒,该表达盒的插入使腺病毒E1***缺失,但是保留其两端侧翼序列(左侧的1~3bp的ITR,右侧从3.5kb到末端的维持病毒装配和活力必须的蛋白IX的***),也保留了腺病毒的包装信号
φ(194~358bp);pBHG11则保留了腺病毒***组的绝大部分,但是缺失了包装信号φ、0.5~3.7图距(mu)部分的E1区、77.5~86.2mu的E3区,293细胞是整合有Ad5 E1***的人胚shen细胞系。pBHG11因为缺失包装信号及E1区而不能copy,pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列,但是缺失E1区及腺病毒绝大部分***组,同样不能copy。外源目的***插入pCA13后,与pBHG11共转染,进入293细胞。pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组,同时,293细胞提供E1蛋白,从而包装产生腺病毒颗粒。该病毒的蛋白质外壳同野1生型腺病毒相似,具有同样的感1染力进入靶1细胞的能力,但是***组DNA的E1区被外源目的***取代,即进入靶1细胞后病毒不能copy,但可以表达目的蛋白。
腺病毒的***组
腺病毒的***组以线性的双链DNA形式存在,由蛋白VII和一种称为mu的小蛋白紧密地环绕在其周围,起到类组蛋白样的作用。另一种蛋白V将这种DNA-蛋白复合物连接起来,并通过蛋白VI与病毒衣壳连接在一起。在两条链的5′端各以共价键结合着一个被称为DNA末端蛋白(pTP)复合物(DNA-TPC)的特化的结构,与腺病毒copy密切相关。腺病毒***组的两端各有一段100bp的反向末端重复序列(ITR),是copy的起始位点。在左端ITR的3′侧有一段长约300bp的包装信号(ψ)介导腺病毒***组包装入病毒衣壳。对腺病毒而言,只有包括两端的ITR和包装信号(ψ)的约0.5kb的序列是顺式作用元件,也就是说必须由腺病毒载体自身携带,而其他的30余种蛋白都可以通过辅助病毒(或细胞)反式补足。
腺病毒传播特点
宿主范围广对人致病性低,腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感1染一系列哺乳动物细胞,因此在大多哺乳动物细胞和***中均可用来表达重组蛋白。特别需要指出的是:腺病毒具有嗜上皮细胞性,而人类的大多数的肿1瘤就是上皮细胞来源的。另外,腺病毒的copy***和致病***均已相当清楚,在人群中早已流行(70-80%成***内都有腺病毒的中和抗1体存在)。人类感1野1生型腺病毒后仅产生轻微的自限性症状,且病毒唑cure有效。
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