核糖核酸(缩写为RNA,即Ribonucleic Acid),存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸,核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种,即A(腺piao呤)、G(鸟piao呤)、C(胞***H4N2)、U(尿***H4N2),其中,U(尿***H4N2)取代了DNA中的T。核糖核酸在体内的作用主要是引导蛋白质的合成。
***一个细胞含RNA约10pg(含DNA约7pg)。与DNA相比,RNA种类繁多,分子量较小,含量变化大。RNA可根据结构和功能的不同分为信使RNA和非编码RNA。非编码RNA分为非编码大RNA和非编码小RNA。非编码大RNA包括核糖体RNA、长链非编码RNA。非编码小RNA包括转移RNA、核酶、小分子RNA等。小分子RNA(20~300nt)包括 miRNA、 SiRNA、 piRNA、scRNA、 snRNA、 snoRNA等,***也有小分子RNA(50~500nt)。
RNA抽取一般使用Trizol法抽提:
Trizol是一种总RNA抽提***,内含异硫qing酸胍等物质,能迅速裂解细胞,***细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取***或细胞中的RNA。
Trizol作用原理:
在匀质化或溶解样品中,Trizol***可保持RNA的完整性,同时能***细胞及溶解细胞成分。加入氯1仿离心后,裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。
水相转移后,RNA通过异丙1醇沉淀回收。移去水相后,用乙醇可从中间相沉淀得到DNA,加入异丙1醇沉淀可从有机相得到蛋白质。
为什么用无水乙醇沉淀DNA
用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中较常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶, 乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。
DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合。一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的***终含量占67%左右。 因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。
但是加95%的乙醇使总体积增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA损失也增大, 尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵, 后面的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙1醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。
病毒核酸提取就像'针尖上跳舞'
检验的首要一步是病毒核酸提取,这也是******的一步,需要在专门的生物安全二级实验室里进行。检测人员要在清洁区穿戴两套防护服、两副乳胶手套,戴护目镜,穿靴套,前后穿过6道门,才能到达核心实验区,病毒核酸提取就像是“针尖上的舞蹈”。“每次脱下防护服,衣服都湿透了。在2—4个小时的病毒核酸提取实验过程中,一般都会安排两人一组进行检验,既是规定要求,也是防止工作人员在密闭的负压实验空间里出现意外。
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