PCR的创建

Khorana (1971)等***早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA***。”但由于当时***序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有实际意义。加上分子克1隆技术的出现提供了一种克1隆和扩增***的途径，所以Khorana的设想被人们遗忘了。

1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。

1983年12月，Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第yi个PCR片段；

1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。

1985年10月25日申请了PCR的专1利，

1987年7月28日批准（专1利号4,683,202 ），Mullis是第yi个发明人；

1985年12月20日在Science杂志上发表了第yi篇PCR的学术论1文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。

反向PCR( Inverse PCR, IPCR术

原理:反向PCR是克1隆已知序列旁侧序列的一种方法，主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化***组DNA.后酶切片段自身环化.以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA的部分片段，大小取决于.上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。

该方法的不足是:①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA部分片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核***组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Co***id中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个***序列杂交。

随机引物扩增技术(arbitrary primedPCR, AP- PCR)

AP-PCR技术通过随意设计或选择一个非特异性引物.在PCR反应体系中.首先在不严格条件下使引物与模板中许多序列通过错配而复性。如果在两条单链上相距一定距离有反向复性引物存在,则可经Taq酶的作用使引物延伸而发生DNA部分片段的扩增。经一至数轮不严格条件下的PCR循环后，再于严格条件下进行扩增。扩增的产物经DNA测序凝胶电泳分离后.经放1射性自显影或荧光显示即可得到DNA***图。AP-PCR用于肿1瘤的******、******的分离;菌1种、菌株及不同物种的鉴定;遗传作图;不同分化程度或某些不同状态下的***的***表达差异等方面的研究。

原位PCR仪

它是由主机，加热模块，玻片，热盖，控制软件组成。主要是应用对细胞或***内的DNA部分片段进行原位扩增分析-即***分析，如病源***在细胞的位置或目的***在细胞内的作用位置等。是保持细胞或***的完整性，使PCR反应体系渗透到***和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行***扩增，不但可以检测到靶DNA，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究***的发病机理和临床过程及病理的转变有重大的实用价值。它无需将细胞破碎提取DNA，细胞内有DNA酶的作用扩增受到一定的影响，使用不是很普遍。

该仪器主要应用于***临床研究，如***细胞等。