DNA连接酶主要用于产生新的核酸分子组合，及在将其连接到载体上

这三个连续的步骤在连接酶的三个不同域进行，与双链DNA接触的各个域环绕DNA底物形成反应域。DNA连接酶主要用于产生新的核酸分子组合，以及在分子克1隆前将其连接到载体上。

用于分子克1隆的DNA连接酶是***来源或者噬菌体编码。所有真***，无论是嗜热或嗜温，包含一个单一的连接酶***，编码NAD*-依赖型的酶(Olivera and Lehman1967; Takahashi et al. 1984)。

在连接反应的第yi步中， 使用NAD的二磷酸作为磷酸1酐键和腺营基团转移到DNA连接酶赖氨酸残基的ε-氨基基团。腺苷酸残基然后转移到DNA底物的5-磷酰基末端，变得易于受到并列的3'羟基基团的亲核攻击。

这导致磷酸二酯键的形成，消去AMP,以及形成DNA链的共价连接。用于分子克1隆的DNA连接酶在连接非经典底物时能力有所不同，如平末端双链、DNA-RNA杂交体或单链DNA.这些以及其他的属性归纳于表5。分子克1隆中比较常用的催化体外连接的酶是T4噬菌体编码的DNA连接酶。

碱性磷酸酶

***在怀孕，以及骨骼成长中遭受某种类型损伤后会将碱性磷酸酶释放进血流。碱性磷酸酶是一种由肝1脏产生的蛋白质并可以在所有***器1官中发现它。在儿童和青少年的骨骼成长过程中，骨头中的磷酸酶数量相对较高。医生能通过血检了解碱性磷酸酶，如果水平过高就说明存在一些健康问题。然而，碱性磷酸酶只是帮助医生找出潜在原因的其中一个指数。

长***组序列、特别是包含大的***簇的那些的克1隆对于产生medicine和生物燃料的合成生物学和***工程工作特别重要。传统的基于PCR的克1隆方法通常受限于DNA模板的长度和GC含量：标准的PCR反应常规产生至多10 kb的片段，而更长的PCR产物需要反应条件的繁琐优化，并且甚至在理想条件下，通常受限于35 kb5。或者，可通过装配多个短片段，例如重叠PCR产物或化学合成的DNA寡聚物，产生长的目的***组序列，但这样的方法趋于耗时和昂贵，特别是对于获得长于50 kb的序列(其通常需要3-5阶段，每个包含多个装配事件)6,7。获得长的***组序列的另一方法是通过***组DNA的限制性酶消化。