ELISA定量测定

ELISA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线***高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数值，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，***较呈直线的部分是相对理想的检测区域。

测定小分子量物质常用竞争法，其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因***盒所用模式的差别而略有不同。ELISA测定的标准曲线注意图中横坐标为对数关系，这更有利于测定系统的表达。

植物ＤＮＡ的ＳＤＳ提取法：1 取2-3ｇ新鲜叶片,在液氮中研磨成粉状(防止溶化)后转入15ｍｌ离心管中。2 加入5ｍｌ于65℃预热的提取缓冲液,65℃水浴保温30ｍｉｎ(摇动数次),使提取液与样品充分混合。3 加入2ｍｌ5ｍｏｌ/ＬＫＡｃ,剧烈振荡,冰浴保温20ｍｉｎ以上。4 2700×ｇ离心20ｍｉｎ,将上清液倒入新的15ｍｌ离心管中,(若提取ＤＮＡ用于Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等实验,一般在转移上清时加滤膜,防止样品残渣混入,可保证ＤＮＡ纯度)。5 加入4ｍｌ氯1仿/异戊1醇(24∶1),摇匀,平衡,2700×ｇ离心15ｍｉｎ。6 在另一新的15ｍｌ离心管中加入5ｍｌ预冷的异丙1醇,将上清液用移液枪转入此管,在-20℃冷却30ｍｉｎ以上。7 2700×ｇ离心10ｍｉｎ,弃去上清液,用4ｍｌ70%乙醇洗涤,室温保持10ｍｉｎ。2700×ｇ离心3ｍｉｎ,倒去上清液。8 重复步骤7,用4ｍｌ70%乙醇洗涤,室温保持10ｍｉｎ。2700×ｇ离心3ｍｉｎ,倒去上清液。超净工作台内吹干(3ｈ左右)。9 加1ｍｌＴＥ缓冲液中溶解,加10μｌＲＮａｓｅ(10ｍｇ/ｍｌ),在37℃恒温箱中温育20ｍｉｎ。10 再加100μｌ3ｍｏｌ/ＬＮａＡｃ和2ｍｌ无水乙醇,2700×ｇ离心3ｍｉｎ,倒去上清液。超净工作台内吹干(3ｈ左右)。11 将ＤＮＡ沉淀溶于150μｌＴＥ中,置于超净工作台内(3ｈ左右)。将ＴＥ溶液转入已灭菌的1 5ｍｌｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中,-20℃保存备用。

植物ＤＮＡ的ＣＴＡＢ提取法：

1 称取新鲜叶片2-3ｇ,剪碎放入研钵中,在液氮中研磨成粉末。

2 将粉末转移到的加有7ｍｌ经预热的1 5×ＣＴＡＢ提取缓冲液15ｍｌ离心管中,迅速混匀后置于65℃水浴中,温育30ｍｉｎ。

3 取出离心管,冷却至室温,加入氯1仿/异戊1醇(24:1),充分混匀,室温下2300×ｇ离心20ｍｉｎ。

4 将上清转移至另一新的15ｍｌ离心管中,加入1/10体积10%的ＣＴＡＢ和等体积的氯1仿/异戊1醇。充分混匀,2300×ｇ离心20ｍｉｎ。

5 转移上清至另一新的15ｍｌ离心管中,加入等体积1%的ＣＴＡＢ沉淀缓冲液,轻轻摇晃至形成ＤＮＡ絮状沉淀。1000×ｇ离心10ｍｉｎ,使ＤＮＡ沉淀于管底。

6 加入1 5-2ｍｌ的1ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ及5μｌＲＮａｓｅ置于56℃水浴中过夜。待ＤＮＡ完全溶解后,加2-3ｍｌ4℃预冷的95%的冰乙醇使ＤＮＡ沉淀,挑出ＤＮＡ,置于1 5ｍｌ离心管中,用70%乙醇清洗30ｍｉｎ,用离心机甩5ｓ,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5ｍｉｎ,倒出95%乙醇,在超净工作台上吹干。

7 将风干的ＤＮＡ直接在4℃保存备用或溶于100μｌＴＥ溶液中于-20℃保存。