PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

污染的监测

一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

1、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下）。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR***经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

2、阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括：

  （1）标本对照：被检的标本是血1清就用鉴定后的正常血1清作对照；被检的标本是***细胞就用相应的***细胞作对照。

  （2）***对照：在PCR***中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增，以监测***是否污染。

3、重复性试验。

4、选择不同区域的引物进行PCR扩增。

PCR有哪些应用领域？

***表达

通常可通过PCR来检测不同细胞类型、***和生物体在特定时间点的***表达差异。首先，从目标样品中分离出RNA并将mRNA逆转录成cDNA。随后，通过由PCR扩增的cDNA数量，确定mRNA的初始水平。这一过程也被称为逆转录PCR。

终点PCR 可通过凝胶里的扩增产物条带强度对RNA的表达进行定量（一种半定量方法）。例如，对起始cDNA进行连续稀释并扩增。通过凝胶电泳使不同起始量的终点PCR得率可视化，然后对条带强度进行定量，并以管家***为参照进行标准化，预估扩增靶点的相对表达水平。如今，终点PCR已基本被实时PCR 或qPCR 取代了，因为它们可获得和的***表达定量结果。

目前的病毒核酸检测***盒，多数采用荧光定量PCR方法，通过检测荧光信号的累积来确定样本中是否含有病毒核酸。那么，核酸检测到底需要经过哪些步骤呢？概括起来，是 取样、留样、保存、核酸提取和上机检测五个步骤。

取样

采集***的分泌物。用鼻咽拭子或咽拭子擦拭鼻腔或咽后壁及双侧扁桃体处

留样

将拭子头浸入细胞保存液中，折断尾部后立即旋紧管盖

保存

将样本管放入密封袋中保存好，并及时送检

核酸提取

将样本送进实验室进行核酸提取

上机检测

将提取物进行荧光PCR扩增反应