DNA连接酶不需要模板，因为DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。用DNA连接酶连接具互补粘性末端的DNA1片段或是用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA1片段连接起来。

DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链。DNA聚合酶的结构是三磷酸腺苷。

当DNA聚合酶 III沿着滞后链模板移动时，由特异的引发酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶 III所延伸，合成DNA。当合成的DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及刚合成的冈崎片段从DNA聚合酶 III上释放出来。由于copy叉继续向前运动，便又产生了一段单链的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶 III,通过DNA聚合酶III开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这种机制，前导链的合成不会超过滞后链太多，这样引发体在DNA链上和DNA聚合酶 III以同一速度移动。在copy叉附近，形成了以DNA聚合酶 III二聚体、引发体和解旋酶构成的类似核糖体大小的以物理方式结合成的复合体，称为DNA copy体。copy体在DNA前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链，以及由许多冈崎片段组成的滞后链。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶I通过其 5'→3'外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，并利用后一个冈崎片段作为引物由 5'→3'合成DNA填补缺口。***后由DNA连接酶将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA滞后链。

制备互补DNA，往往需要先分离从目的***转录来的mRNA.如果该***编码的蛋白质是细胞中的主要蛋白质，则此***的产物是总mRNA的主要组成部分 。就胰岛B细胞而论，此细胞含有高水平胰岛素前体mRNA，后者有时可以沉淀正在翻译的mRNA的核糖核蛋白体，如果用特异结合所表达的蛋白质(抗原)，则可从沉淀的核糖体中分离出胰岛素特异的mRNA，一般特异mRNA只是细胞总mRNA中的次要成分。在这种情况下，不得不以密度梯度离心，按分子量大小把总mRNA分开，然后把分离开的mRNA直接用于试管中表达蛋白质(用家兔网织细胞的溶胞产物或小麦胚芽提取物作为翻译系统的诱导物)再用沉淀或聚酰胺凝胶电泳从许多表达的蛋白中测定出目的蛋白，从而确定表达该蛋白的特异mRNA。