巢式PCR(NEST PCR枝术.
先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量.然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带。此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少 巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些,且用量较少。同时在第yi次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度。这样在第yi次PCR时,由于较高退火温度下内引物不能与模板结合,故只有外引物扩增产物,经过若干次循环。待外引物基本消耗尽,无需取出第yi次PCR产物,只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤。同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR( drop-in, drop-out PCR)上述三种方法主要用于少量DNA模板的扩增。
差示PCR (differential PCR, d -PCR)技术
d-PCR可以定量检测标本靶***的拷贝数。它是将目的***和一个单拷贝的参照***置于一个试管中进行PCR扩增。电泳分离后呈两条区带,比较两条区带的丰度,或在引物5°-端标记上放1射性核素后.通过检测两条区带放1射性强度即可测出目的***的拷贝数。
定量PCR(quantitative PCR, qPCR)技术
qPCR技术是用合成的RNA作为内标来检测PCR扩增目的mRNA的量,涉及目的mRNA和内标用相同的引物共同扩增.但扩增出不同大小片段的产物.可容易地电泳分离。一种内标可用于定量多种不同目的mRNA。qPCR可用 于研究***表达。能提供特定DNA***表达水平的变化.在***1症、代谢紊乱及自身免1疫性***的诊断和分析中很有价值。
PCR有哪些应用领域?
***表达
通常可通过PCR来检测不同细胞类型、***和生物体在特定时间点的***表达差异。首先,从目标样品中分离出RNA并将mRNA逆转录成cDNA。随后,通过由PCR扩增的cDNA数量,确定mRNA的初始水平。这一过程也被称为逆转录PCR。
终点PCR 可通过凝胶里的扩增产物条带强度对RNA的表达进行定量(一种半定量方法)。例如,对起始cDNA进行连续稀释并扩增。通过凝胶电泳使不同起始量的终点PCR得率可视化,然后对条带强度进行定量,并以管家***为参照进行标准化,预估扩增靶点的相对表达水平。如今,终点PCR已基本被实时PCR 或qPCR 取代了,因为它们可获得和的***表达定量结果。
突变:PCR克1隆的一大优点是能够通过克1隆将所需突变引入目的***中,以便进行突变研究。在 定1点突变中,经过设计的PCR引物可将碱基置换、删除或插入整合到特定序列中。引物***到已克1隆至质粒中的序列上。随后,含有引入突变的PCR产物通过自我连接,重新生成环状质粒,并用于转化感受态细胞。
测序:PCR是为测序富集模板DNA的一种相对简单的方法。为保证DNA序列准确性,强烈建议使用高保真PCR来制备测序模板。在 Sanger测序中,PCR扩增片段经纯化并用于测序反应。使用常用的测序引物结合位点对PCR引物的 5′末端进行标记,以简化测序工作流程。
二代测序 (NGS)中,PCR被广泛用于构建DNA测序文库。在NGS文库制备中,DNA样品通过PCR反应富集(在起始量有限的情况下)并使用adaptor(以及用于多重检测的index)标记。除了具有高保真度,DNA聚合酶还应具有***小的扩增偏好性,从而使测序文库具有高覆盖度。
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