限制性酶切分析法

限制性酶切分析法是指***组或一段核酸用限制性内切酶消化产生的片段经电泳等方法分离形成特别的条带图谱，对DNA序列的特征进行的分析。限制性酶是生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的***并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用。

限制酶是***工程中所用的重要切割工具。科学家已从原核生物中分离出了许多种限制酶，并且已经商品化，在***工程中广泛使用。根据限制酶切割的特点，可将它们分为两大类：一类是切割部位无特异性的；另一类是可特异性地识别核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上进行切割。

质粒载体和外源ＤＮＡ中限制酶切位点的性质

    如今，质粒载体中限制酶切位点的种类极为繁多，因而通常都有可能找到某种带限制酶切位点恰恰与外源ＤＮＡ部分片段本身毫无二致的载体。这就具备一个不可1比拟的优点，也应是可以用相应的限制酶消化重组质粒崦回收外源ＤＮＡ。另一种方案，则是把片段插入到载体中能产生匹配末端的任何位点中。例如，识别不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ产生具有相同突出末端的限制酶切片段，这样用BglⅡ消化而制备的外源ＤＮＡ部分片段可以克1隆到用BanHl消化的质粒中。这通常会使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制备载体的任何一种酶所切开。然而很多清况下，用切点位于多克1隆序列侧翼的限制酶进行消化，可将片段从重组质粒中摘出。偶尔在质粒的以及外源ＤＮＡ两端的限制酶切位点之间，不可能找到“门当户对”的搭配关系。这时可用下面两种方案加以解决：

   1）在线状质粒末端和（或）外源ＤＮＡ部分片段的末端接上合成在接头或衔接头。

   2）在得到控制的反应条件下，用大肠杆1菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分补平带3凹端的ＤＮＡ部分片段。如第九章所讨论，这样常可以使那些不相匹配的限制酶切位点转变为互补末端，从而促进载体和外源ＤＮＡ的连接。因为部分补平的反应消除了同一分子两端彼此配对的能力，故连接反应过程中环化和自身寡聚化的机会也会有所降低

限制性内切酶的质量控制鉴定

限制性内切酶的一个活性单位是指，在50μl 的反应体系里，采用随酶提供的 NEBuffer，用1个小时的时间，消化1μg底物DNA所需要的酶量。酶切反应应在带盖的eppendorf 管中进行，选用技术数据卡上所标明的适宜温度。在确定酶活性之前，浓缩的酶应该用推荐的贮存液稀释成大约1,000 单位/ml。

质量控制

所有质量控制鉴定结果都公布在随酶提供的技术数据卡上。

核酸酶污染的过夜鉴定

　　所有的限制性内切酶与1μg 底物DNA在50μl反应体系中，采用推荐的NEBuffer温育过夜。比较酶切1小时的特征带型和过夜酶切的带型。如果两种情况下带型均明显、没有改变，则说明测试的酶中不存在非特异性的dna酶。可以温育过夜的***大酶单位数。

核酸外切酶污染鉴定

　　所有的限制性内切酶与1μg 单双链混合的、3H标记的E.coli DNA在50μl反应体系中，采用随酶提供的NEBuffer，在推荐的温度下温育4小时。通过可溶解的TCA着色，可以计算出反应体系中被标记的DAN的百分比，进而可以显示出核酸外切酶的污染。该种方法可检测出的底线是0.05%。