DNA连接酶主要用于产生新的核酸分子组合，及在将其连接到载体上

这三个连续的步骤在连接酶的三个不同域进行，与双链DNA接触的各个域环绕DNA底物形成反应域。DNA连接酶主要用于产生新的核酸分子组合，以及在分子克1隆前将其连接到载体上。

用于分子克1隆的DNA连接酶是***来源或者噬菌体编码。所有真***，无论是嗜热或嗜温，包含一个单一的连接酶***，编码NAD*-依赖型的酶(Olivera and Lehman1967; Takahashi et al. 1984)。

在连接反应的第yi步中， 使用NAD的二磷酸作为磷酸1酐键和腺营基团转移到DNA连接酶赖氨酸残基的ε-氨基基团。腺苷酸残基然后转移到DNA底物的5-磷酰基末端，变得易于受到并列的3'羟基基团的亲核攻击。

这导致磷酸二酯键的形成，消去AMP,以及形成DNA链的共价连接。用于分子克1隆的DNA连接酶在连接非经典底物时能力有所不同，如平末端双链、DNA-RNA杂交体或单链DNA.这些以及其他的属性归纳于表5。分子克1隆中比较常用的催化体外连接的酶是T4噬菌体编码的DNA连接酶。

DNA新链的延伸由DNA聚合酶 III所催化。为了copy的不断进行，解旋酶须沿着模板前进, 边移动边解开双链。由于DNA的解链，在DNA双链区势必产生正超螺旋，在环状DNA中更为明显，当达到一定程度后就可能造成copy叉难以再继续前进，但在细胞内DNA的copy不会因出现拓扑学问题而停止，因为拓扑异构酶会解决这一问题。

随着引发体合成RNA引物，DNA聚合酶 III开始不断地将引物延伸，合成DNA。DNA聚合酶 III是一个多亚基复合二聚体，一个单体用于前导链的合成，另一个单体用于滞后链的合成，因此它可以在同一时间分别copyDNA前导链和滞后链。虽然DNA前导链和滞后链copy的方向不同，但如果滞后链模板环绕DNA聚合酶III,并通过DNA聚合酶 III,然后再折向未解链的双链DNA的方向，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向进行。

遗传控制中大的困难并不是DNA的，而是需要被的特异DNA段的分离 [2]  。如果以***为目的，特异DNA段的分离将大大有助于获得与遗传信息同样多的相关的***产物，一般说这些***产物均为蛋白质多肽，因此抗该蛋白质的对于测定和沉淀蛋白质及其前体有重要用途，甚至可用于了解蛋白质分子量 [2]  。AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成的引物是与真核细胞mRNA分子3’端poly（A）结合的12～18个核苷酸长的oligo（dT）。