tRNA二级结构

约50%碱基配对，形成四段双螺旋，与五段非配对序列形成三叶草形结构。

该结构中存在四臂四环：

①氨基酸臂。 

②二氢尿***H4N2臂（DHU臂、D臂）和二氢尿***H4N2环（DHU环、D环），特征是含二氢尿***H4N2（DHU、D）。 

③反密码子臂和反密码子环，特征是反密码子环含反密码子。反密码子5′端与尿苷酸连接，3′端与piao呤核苷酸连接。TΨC臂（T臂）和TΨC环（Ψ环），特征是TΨC环含胸腺***H4N2核糖核苷酸T54假尿苷酸Ψ55胞苷酸C56。

④额外环3~21nt。

tRNA三级结构呈L形，氨基酸结合位点位于其一端，反密码子环位于其另一端，DHU环和TΨC环虽然在二级结构中位于两侧，但在三级结构中却相邻。尽管各种tRNA的长度和序列不尽相同，但其三级结构相似，提示三级结构与其功能密切相关。

PCR产物的回收（胶回收***盒）

1.胶回收的目的（1）去除非特异性扩增的产物（2）去除多余的底物（3）去除多余的Taq酶（4）得到目的片段

2.胶回收的过程（1）切胶：紫外下切胶，称重。之后用枪头将胶块捣碎。切胶的刀片建议选用一次性刀片，实验台等也尽可能用乙醇擦拭干净。可通过空EP管与装胶EP管质量的差值计算胶的质量。注意切胶时尽可能避免切到条带外的凝胶，且避免紫外时间过长。别忘记胶条有厚度，前后多余的部分也尽量切除。（2）溶胶：每1 mg胶加入1 μL膜结合液（MB），按比例1:1加入MB，55℃水浴溶解。每1~2 min震荡混匀，待溶解后至少在水浴中保持1~2 min，保证胶块完全溶解。在电泳过程中，DNA会与大分子的多糖紧密结合，凝胶的种类和质量不同，DNA与之结合力也不同，只有凝胶充分溶解DNA才能充分释放。否则，凝胶将与DNA一起沉淀下来，洗脱后将影响回收结果的纯度。（3）结合：将溶胶转移至纯化柱内，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将纯化柱重新插回收集管中。胶块完全溶解后建议将胶液温度降至室温再上柱，因为纯化柱在温度较高时结合DNA的能力较弱。

为什么用无水乙醇沉淀DNA

　　用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中较常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶， 乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

　　DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的***终含量占67%左右。 因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。

　　但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大， 尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵， 后面的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙1醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。

用乙醇沉淀DNA时为什么一定要加NaAc或N***

　　在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或N***，使Na+中和DNA分子上的负电荷， 减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时， 只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时， 其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

　　加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理?

　　加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、*抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。

　　在***操作实验中，磷酸盐缓冲系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定。