PCR引物设计的基本原则

引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC建议随机分布，避免5个以上的piao呤或嘧1啶核苷酸的成串排列参照。

引物内部不应出现互补序列。

两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，

引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。引物3‘端的碱基，特别是***末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，***佳选择是G和C。

引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地1高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

 PCR反应五要素

参加PCR反应的物质主要有五种即引物(PCR引物为DNA部分片段,细胞内DNA复1制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)。

[PCR步骤]标准的PCR过程分为三步:

1.DNA变性(90°C-96*C): 双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

2.退火(25C-65'C): 系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸(70°C-75*C): 在Taq酶(在72C左右，活性***佳)的作用下，以dNTP为原料，从引物的5'端→3'端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是***佳也能在很短的时间内copy完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60°C -65C间进行，以减少一次升降温过程，提

高了反应速度。

原位PCR仪

它是由主机，加热模块，玻片，热盖，控制软件组成。主要是应用对细胞或***内的DNA部分片段进行原位扩增分析-即***分析，如病源***在细胞的位置或目的***在细胞内的作用位置等。是保持细胞或***的完整性，使PCR反应体系渗透到***和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行***扩增，不但可以检测到靶DNA，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究***的发病机理和临床过程及病理的转变有重大的实用价值。它无需将细胞破碎提取DNA，细胞内有DNA酶的作用扩增受到一定的影响，使用不是很普遍。

该仪器主要应用于***临床研究，如***细胞等。