***枪转化法

气动式***枪中具有代表性的是PDS-1000/He，利用由不同厚度的聚苯四甲酰亚1胺膜制成的可裂圆片来调控氦气压力。当氦气压力达到可裂圆片的临界承受压力时，可裂圆片破1裂并产生强烈的气流，使微弹载体携带微弹高速运动，遇到刚性的阻挡网，微弹载体被阻遏，而微弹利用惯性继续向前高速运动，轰击靶1细胞或***，从而携带外源***进入细胞内。***枪法不再受到受体***型的限制，又能避开原生质体再生的障碍，从而使植物的遗传转化翻开了新的一页。

***枪转化法在植物遗传转化中的应用：应用***枪法转化***早的是Klein等人在1987年将携带有***氯霉1素乙酰转移酶（cat）***的烟1草花叶病毒的RNA导入洋葱的表皮细胞，使此***得到表达。后来，随着对物理参数（如金属粒子的理化特性、DNA与金属粒子的结合和靶***特性等）、环境条件（如受体植株、外植体和靶***所适宜的温度、湿度和光照等）和生物因子（如外植体及其轰击前后的培养条件等）等的技术优化，不断完善的***枪转化技术能实现对许多受体材料的转化，包括原生质体、悬浮细胞系、愈伤***、外植体（幼穗、幼胚或成熟胚），甚至可以直接轰击转化花粉。

电1击法

　　电1击法基本原理是电脉冲使细胞膜产生可逆性的“微孔”，外源DNA可通过这些微孔进入受体细胞原生质体内。

　　1985年Fromm等用electric shock法将pat***导入了玉米原生质体，得到了该***稳定表达的愈伤***。随着玉米原生质体再生技术的研究取得进展，1988年Rhodes等用electric shock法转化玉米原生质体，初步获得了完整的转0***植株。electric shock法还可以对幼胚、愈伤***和胚性悬浮细胞系进行遗传转化。1992年D’Hallum K等以玉米幼胚和愈伤***为受体，用electric shock法导入neo***，获得了可育的转0***植株，并且neo***能稳定地遗传给后代。1993年Sukhapinda等用electric shock法转化从玉米花粉愈伤***分离的原生质体，将gusA和nptⅡ转入原生质体，获得单倍体转化植株。1994年Laursen等以果胶降解酶处理悬浮细胞系后，通过electric shock法导入bar***，也获得了可育的转0***玉米。

　　电1击法操作简单，不受宿主限制，在遗传转化技术研究的初期得到了较为广泛的应用，但是它的转化效率较低，而且对有壁细胞或***的转化效果较差。

科学家在培养转0***植物时，常用什么中的质粒作为载体？

（1）具有较小的分子量。经验表明，为了避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂，克1隆载体的分子大小建议不要超过10Kb。pBR质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA部分片段；

（2）具有两种抗1菌素抗性***可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。标记***往往可以赋予宿主细胞一种新的表型，这种转化细胞可明显地区别于非转化细胞。当我们把一个DNA部分片段插入到某一个标记***内时，该***就失去了相应的功能。当把这种重组DNA分子转到宿主细胞后，该***原来赋予的表型也就消失了。要是仍保留了原来表型的转化细胞，细胞内含有的DNA分子一定不是重组子。很显然，既要指示外源DNA是否进入了宿主细胞，又要指示载体DNA分子中是否插入了外源DNA部分片段，那么这种载体必须至少具有两个标记***。另外，pBR质粒载体还具较高的拷贝数，而且经过氯霉1素扩增之后，每个细胞中可积累1000~3000个拷贝，这就为重组体DNA的制备提供了极大的方便。

***导入细胞常用方法

不同的载体在不同的宿主细胞中繁殖，导入细胞的方法也不相同。

由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化，早在1943年，***ery等就发现***肺1炎双球菌的DNA与***肺1炎双球菌共培养后产生***性的肺1炎双球菌后代的转化现象。但DNA进入细胞的效率很低，在分子生物学和***工程工作中可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源DNA接触，就能提高转化效率。例如大肠杆1菌经冰冷C***2的处理，就成为感受态***，当加入重组质粒并突然由4℃转入42℃作短时间处理，质粒DNA就能进入***；用高电压脉冲短暂作用于***也能显著提高转化效率，这称为电穿孔（electroporation）转化法