RNA***盒注意事项

所有相关器皿耗材都应为RNase-free产品，操作过程要小心，带口罩、手套避免环境中RNA酶污染样品。

RNA在水溶液中OD值可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯，需电泳检测。

使用时一定要根据自己的实验需要购买专1用提取***盒， 如果不是专1用***盒，或许能提出RNA，但不能确保其质量以及完整性，会影响RT-PCR、Northern blot、Dot blot、Real time RT PCR、芯片分析、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析、分子克1隆等后续实验的结果。

当前提取效果好的是RNA提取***盒，但其售价较高，单次实验费用花费太大，对精度要求不高的实验没有必要购买，当然还有其它的进口***盒，但是均存在价格高、订货周期长的问题（如果碰上国内无货的时候，要从国外发货，会等很长一段时间）。普通的提取实验用国产的***盒就足以，价格不高，基本上各地均有现货，如天根（国内生产的***盒中销售面比较广的一种）等，其价格比进口***盒要便宜许多，且效果还不错，还可以

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:

Trizol是一种总RNA抽提***，内含异硫qing酸胍等物质，能迅速裂解细胞，***细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取***或细胞中的RNA。

Trizol作用原理:

在匀质化或溶解样品中，Trizol***可保持RNA的完整性，同时能***细胞及溶解细胞成分。加入氯1仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。

水相转移后，RNA通过异丙1醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙1醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

用乙醇沉淀DNA时为什么一定要加NaAc或N***

　　在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或N***，使Na+中和DNA分子上的负电荷， 减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时， 只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时， 其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

　　加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理?

　　加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、*抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。

　　在***操作实验中，磷酸盐缓冲系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定。