腺病毒提取欢迎来电 武汉友名生物公司
作者:友名生物2021/11/3 2:46:20







典型的腺病毒载体系统如:穿梭质粒pCA13/腺病毒***组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。pCA13/的HCMV IE启动子-多克1隆位点-SV40 AN(poly A)构成外源***的表达盒,该表达盒的插入使腺病毒E1***缺失,但是保留其两端侧翼序列(左侧的1~3bp的ITR,右侧从3.5kb到末端的维持病毒装配和活力必须的蛋白IX的***),也保留了腺病毒的包装信号

φ(194~358bp);pBHG11则保留了腺病毒***组的绝大部分,但是缺失了包装信号φ、0.5~3.7图距(mu)部分的E1区、77.5~86.2mu的E3区,293细胞是整合有Ad5 E1***的人胚shen细胞系。pBHG11因为缺失包装信号及E1区而不能copy,pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列,但是缺失E1区及腺病毒绝大部分***组,同样不能copy。外源目的***插入pCA13后,与pBHG11共转染,进入293细胞。pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组,同时,293细胞提供E1蛋白,从而包装产生腺病毒颗粒。该病毒的蛋白质外壳同野1生型腺病毒相似,具有同样的感1染力进入靶1细胞的能力,但是***组DNA的E1区被外源目的***取代,即进入靶1细胞后病毒不能copy,但可以表达目的蛋白。



***导入细胞常用方法

转染

  重组的噬菌体DNA也可象质粒DNA的方式进入宿主菌,即宿主菌先经过C***2,电穿孔等处理成感受态***再接受DNA,进入感受态***的噬菌体DNA可以同样copy和繁殖,这种方式称为转染(transfection)。M13噬菌体DNA导入大肠杆1菌就常用转染的方法。重组DNA进入宿主细胞也常用转染方式。***经典的是1973年建立的磷酸钙法,其利用的基本现象是:DNA如以磷酸钙-DNA共沉淀物形式出现时,培养细胞摄取DNA的效率会显著提高。用电穿孔法处理培养的哺乳类细胞也能提高细胞摄取DNA能力,但所用外加电场的强度、电脉冲的长度等条件与处理***者都很不相同。用人工脂质膜包裹DNA,形成的脂质体可以通过与细胞膜融合而将DNA导入细胞,方法简单而有效,但缺点是有细胞毒性和血1清的不亲和性,近年来人们发现了一种更为有效的转染***-阳离子聚合物,其克服了脂质体转染***细胞毒性大,在体内易被血1清清除等缺点,具有转染效率1高,操作简单而日益受到重视。



20世纪40年代以前,对于***的化学本质并不了解。直到1944年O.T.埃弗里等证实双球菌的转化因子是DNA,才用实验证明了***是有遗传效应的DNA段。

1955年S.本泽用大肠T4噬菌体作材料,研究快速溶菌突变型rⅡ的***精细结构,发现在一个***内部的许多位点上可以发生突变,并且可以在这些位点之间发生交换,从而说明一个***是一个功能单位,但并不是一个突变单位和交换单位,因为一个***可以包括许多突变单位(突变子)和许多重组单位(重组子)(见互补作用)。

1969年J.夏皮罗等从大肠中分离到乳糖操纵子,并且使它在离体条件下进行转录,证实了一个***可以离开染色体而***地发挥作用,于是颗粒性的遗传概念更加确立。随着重组DNA技术和核酸的顺序分析技术的发展,对***的认识又有了新的发展,主要是发现了重叠的***、断裂的***和可以移动位置的***。





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