ELISA定量测定

ELISA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线***高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数值，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，***较呈直线的部分是相对理想的检测区域。

测定小分子量物质常用竞争法，其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因***盒所用模式的差别而略有不同。ELISA测定的标准曲线注意图中横坐标为对数关系，这更有利于测定系统的表达。

在选用支原体PCR法检测来替代药典方法时，需要考虑如下两个方面：

首先一步是要使用符合欧洲药典要求，经过全方面验证的支原体检测***盒，第二部是自我验证，即确认所用的样本基质对于该***盒方法是合适的，并且操作过程是正确的。小规模的室内验证通常需要采用三个不同批次的***盒，然后加入10CFU的标准品，做复孔（通常是8个复孔），并且至少选择3个支原体物种进行验证。

有的支原体标准品厂家会提供CFU与***拷贝数的比值，以方便二者的换算。因为10CFU只能确定PCR能够达到的检测限在10CFU以下，但无法具体确定灵敏度的数值。带DNA拷贝数标定的***组DNA标准品则可进一步确定检测限的数值。

总之，PCR方法很有用，但需要避免假阴性，验证时应使用阳性对照、阴性对照、无模板对照和内控对照，以保证PCR反应正常，以及支原体少量存在时确实能检出来，支原体不存在时也确保是结果阴性，从而使得PCR方法在工业应用时能确保***终结果的可靠。

鼻咽拭子的采集

被采集人员需要 保持头部不动，采样人员去除鼻腔内壁的分泌物。然后采样人员一手轻扶被采集人员头部，一手将鼻咽拭子缓缓插入鼻腔至鼻咽部。在鼻咽部，拭子将停留数秒吸取分泌物，而后采样人员轻轻旋转取出拭子，将样本保存并送检。

咽拭子的采集

被采集人员先用 生理盐水漱口，采样人员将拭子放入无菌生理盐水中湿润。被采集人员头部微仰并保持不动，嘴张大，并发“啊”音，露出两侧咽扁桃体，采集人员将拭子越过舌根，在被采集者两侧咽扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次。

需要注意的是，两种采集方法， 被采集人员均会稍感不适，所以在采样的过程中，被采集人员需稍稍克服一下不适感， 配合采样人员的工作。不可过度活动头部，以免拭子划伤粘膜。如被采集人员发生刺激性咳嗽，采集过程需稍作暂停。