冻存袋的原理

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以较大限度的保存细胞活力。如今细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

细胞冻存的操作步骤

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血的冻存培养液；

2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。

3. 去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；

4. 离心1000rpm，5min；

5. 去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的密度为5×106/ml～1×107/ml；

6. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；

7. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

8. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

细胞冻存步骤

1.用移液器吸走原培养基，加入适量PBS洗1-2遍;

2.加入适量胰酶，置于培养箱中消化;

3.待消化到位后加入适量血浆或完全培养基终止消化，800-1000rpm离心3-5min;

4.配制冻存液，待细胞离心后去上清，加入冻存液重悬，调整细胞浓度为3×106~1×107 cells/mL，转移到冻存管中;

5.将冻存管放入程序降温盒中，-80度过夜，然后转移到液氮中保存。

6.冻存细胞后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存，

为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况，再继续冻存

冻存袋的使用

冻存研磨就是为了保持实验材料酶或者核酸的活性，所以要选择少***这些物质的时候称量。我觉得应该是冻存前，但是如果不知道称取多大量，那冻存后称量动作一定要快。不是精细度很高的称量，冻存后称量应该关系不大。

其实冻存研磨大的有点是研磨起来很容易，因为一般的材料都玻璃化了，很容易碎，即使是肉类。但在保存时间不需要太长、材料比较多、研磨也相对容易的时候，不必用液氮，普通冷冻或超低温冷冻保存就可以了，比如叶子等。