冻存袋注意事项

1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好且存活率高之状态，约为80~90%致密度。

冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有antibody之产生。

2.细胞在液氮中可长期冻存没有时间限制，而不会影响细胞活力﹔在-70度可保存数月。注意冷冻保护剂之品质。

DMSO应为***级等级，无菌且无色是直接购买无菌产品，以5~10m1小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。

3.冻存细胞数量要足够。无论再怎么小心，细胞在冷冻和复苏过程中总会死掉一批的。所以，一开始冻存细胞的数量要足够。一般要达到5× 10^6 /毫升，一瓶不够两瓶凑。但是，这个不能一概而论。有些细胞，比如杂交瘤细胞，只需要1-3x 10^6 /毫升

细胞冻存袋方法

1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。

2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。

3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。

5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。

7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟)→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱(－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。

注意：操作时应小心，以免液氮。液氮定期检查，随时补充，不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

动物细胞冻存***

1. 首先准备好用于包装样本的铝箔或冷冻保存管，并且用油性记号笔在铝箔或冻存管外表多处写明样本编号。

2. 准确切除所需***后，立即剔除结缔***和脂肪***等非研究所需的***类型。

3. 在RNase-free 的生理盐水中迅速漂洗样本，以去除血渍和污物。

4. 用准备好的铝箔或冷冻保存管装载包裹***，迅速投入液氮冷却。

5. 填写样本登记单，写明样本名称、***类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。