细胞复苏冻存袋

1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

3. 离心， 1000rpm，5min；

4. 弃去上清液，加入含10%小牛血培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

5. 次日更换一次培养液，继续培养。

冻存袋实验前的准备

生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、等速降温机

冷冻方法理论准备:

(1)传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-8O℃16~18小时(或隔夜)--->液氮槽长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量消失，亦可跳过此步骤直接放入-8O℃冰箱中。

(2）程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至（-8o℃以下) -120℃，再放在液氮槽长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

细胞冻存的原理

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的***条件下，能使细胞内水份在***前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

冻存袋的使用注意事项

1. 如用液氮罐存放样品，包裹***的铝箔或冷冻保存管转入样本袋时，请按以下步骤进行：把样本袋（纱布袋等）放入液氮中冷冻一下，而后将液氮冷却的***放入样本袋

2. 如用广口容器液氮暂存，建议用进口高质量冻存管，油性笔标记后，样品迅速放入管中，拧紧后迅速放入液氮中。然后再转移到超低温冰箱中保存。

3．直接干冰中保存并邮寄的，建议全部用进口冻存管，油性笔标记后，样品迅速放入经干冰预冷的冻存管中，放入样品袋，埋入干冰中，密封包装后，运输。