细胞冻存袋方法

1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。

2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。

3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。

5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。

7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟)→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱(－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。

注意：操作时应小心，以免液氮。液氮定期检查，随时补充，不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

细胞冻存离心问题

目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了会受压过大， 。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒***，所以须将离心后的液 体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。

冻存袋操作流程

（1）冰冻当天进入***局域网，查询当日***间冰冻安排表，大致了解当日的冰冻情况，并提前通知当日负责冰冻送片的初检医生，避免遗漏。

（2）取材前确定标本冰冻报告已发出，核对标本病理号、住院号，准确记录其病理号、住院号、姓名（至少有其中2项）于冻存***登记本上。

（3）在新鲜标本取材台上取材，并使用取材器具，同一天使用频繁时，每取完一例标本器具应清洗后浸泡于消毒液中，以防止其他标本污染。

（4）在不影响外检取材的前提下，充分取材。良变取足够量病灶，病变取足够量病灶及***旁正常***（***旁正常***远离病灶应尽量>2cm）。

（5）将所取标本切割成直径1～2mm的***块，不同标本及同一标本不同部位装入相应冻存管中，做好标记（注意顺序，切取标本、夹放冻存管都应遵循“先正常-后”的顺序，避免***污染）。