ELISA***盒的组成结构

1、 操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内***的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。

2、 血浆：EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

3、 细胞上清液：1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4、 ***匀浆：将***加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液。

5、 保存：如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

此IBL***盒能用于小鼠清,EDTA血浆,细胞上清中白介素-6的定量检测。

ELISA***盒的操作方法——双夹心法

1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。

2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

3.　加酶标：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。

4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。

5.　终止反应：于各反应孔中加入2M***0.05ml。

6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

Elisa***盒——Elisa实验常见问题及解决方案

显色淡，灵敏度偏低

1  ***盒未充分平衡 ***盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有***已平衡至室温（约25℃）

2  样品不适合做ELISA检测 样品一般选择培养上清、血浆。其他样品形式可能不适合做ELISA检测或者需要优化检测的条件（例如稀释液的成分）

3  酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥 防止板过于干燥

4  包被遭到*** 操作温和，移液枪不能碰到孔底

5  样本和孵育条件不合适 按照说明书条件，建议孵育过程中全程振荡孵育。

6  洗涤浸泡时间过长 按照说明书操作。勿人为增加浸泡时间；

7  偶联HRP***污染 弃去***，重新配置

8  错误的稀释偶联HRP*** 弃去***，重新配置

9  TMB底物孵育时间过短，因非人为因素影响，需要优化孵育时间 确定合适的孵育时间：人为判定-高浓度的标准品出现深蓝色；S4-5有淡蓝色；机器判定620 nm波长下测定OD值达到0.6-0.65

10  样本浓度过高或存在基质效应 建议做不同稀释倍数，确认样本稀释倍数。

11  滤光片设置有问题或者波长选择不对 确认仪器设置及选择正确的波长检测。

12  酶标板不适合做ELISA 不能使用细胞培养板，建议使用ELISA高吸附力板子。

重复性不佳，高CV值 

1  样品不均一 加样前充分混匀样品，取样确保移液位置一致；

2  包被板表面遭到*** 洗板加样时尽量小心，避免***板的包被表面

3  孔与孔之间的交叉污染 孵育后取下盖子小心操作，避免孔与孔的污染；封板膜不能重复使用

4  加样量不一致 样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴

5  边缘效应（外周孔显色较中心孔深） 孵育时尽量100 rpm旋转混匀

6  微量加样不准确 保证微量加样的准确性和均一性

7  不正确的洗涤 洗液准确配制；充分洗涤，静置15秒，确定每一步的洗涤