(1)75% (体积分数)酒精消毒孕鼠,在无菌条件下取出胎鼠,分离并切取脊髓,置于冷的无钙、镁的HBSS液的平皿中( 下置冰袋)。

(2)解剖显微镜无菌条件下仔细剥离脊膜及血管。

(3)用弹簧剪将脊髓剪成1cm3大小，消化液37℃消化15-20min，每五分钟振荡一次；

(4)去掉上清，加入终止液终止消化，吹打10-15次，不能有气泡，收集上清，剩余***再消化一次。

(5)4℃1000rpm离心10min，弃上清，加入种植液1重悬，培养箱内差速贴壁30min；

(6)收集上清，台盼蓝染色计数，按6*105cells/孔种入六孔板（种植液1），37℃，5%CO2，95%饱和湿度的培养箱中培养；

(7)培养第二天，全换液更换为种植液2；

(8)培养第四天，半量换液加入5uM的，24h全量换液；

(9)之后每周换液两次。

样品预处理

　　在待测样品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹缠绕，根据不同的细胞和***样品的应用，可选择合适的预处理方法将靶核酸暴露：

　　内源性酶灭活：如果探针的检测是通过酶促法进行的，则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的POD可通过含1%H2O2的甲醛溶液处理30min。如果检测酶为AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP检测的内源性背景一般来说比POD检测的低得多，因为在杂交过程中，样品中内源性AP酶的活性基本都丧失了。

　　RNase处理：在DNA-DNA杂交实验中，RNase的处理可去除内源性RNA，增加实验的信噪比。在进行mRNA为靶标的检测时，RNase处理的样品也可作为质控对照。通常的处理方式是将DNase-free的RNase溶解于2×***(100μg/ml)，样品在溶液中37℃处理60min。

肝纤维化动物模型化学性损伤法：

雄性Wistar大鼠，体重130g左右，用腹腔内***，次20mg/100g体重，从第二次起12mg/100g体重，每周***2次，共8周。

评价:第3周，在肝小叶间中间带出现大片的肝细胞变性坏死和炎细胞浸润，炎细胞浸润、坏死细胞数和程度超过猪模型。6周后出现纤维束，纤维晚于和少于猪模型。大鼠肝纤维***中有I型胶原的mRNA增多。

肝纤维化动物模型

模型概述：

1. 任何可引起肝损伤的因素长期、反复作用于，均可产生肝细胞变性、坏死，继而肝和纤维***，导致肝纤维化。

2. 已有化学性损伤、性、生物学、酒精性和营养性肝纤维化模型。每种方法因致病因素不同，给药途径不同，产生的机理、纤维化出现早晚、稳定性、出现率、重复性及机体自然患病过程相似程度等都不尽相同。