原位杂交技术应用于染色体、细胞和***切片等样品中进行核酸特异性检测,与免6疫组化技术的结合应用,能将DNA、mRNA和蛋白水平上的***活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放9射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交,此后得益于分子克6隆技术的发展,及不同探针标记系统和检测系统的应用,大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。
原位杂交 (ISH) 是用于***固定***和细胞中特定核酸靶标的强大技术,能够获得与***表达和遗传位点相关的时间和空间信息。 虽然ISH的基本工作流程与印迹杂交近似,即核酸探针被合成、标记、纯化和特异性靶标退火,但其不同之处在于前者可通过可视化显示***内的结果来获得更多信息。 如今有两种基本方法来实现可视化显示原位RNA和DNA靶标,即荧光 (FISH) 和显色 (CISH) 检测。 每种检测方法本身的特点(见下表)使得FISH和CISH适用于截然不同的应用。 虽然两种方法均使用标记的、与样本杂交的靶标特异性探针,但每种方法用于可视化显示样本的仪器不同。 这里我们将强调每种方法的不同之处和各自的优势。
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惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加3倍,而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。而短探针不需用促进剂,因其复杂度低和分子量小 ,短探针本身的杂交率就高 。***葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。这是一种多聚胺,平均分子量为500 000。另一种常见的促进剂是聚乙二醇(PEG),PEG分子量小(6000~8000)、粘度低、价格低廉,但它不能完成取代***葡聚糖。在某些条件下5%~10%***葡聚糖效果较好,若用5%~10%PEG则可产生很高的本底。因此,使用促进剂时有必要优化条件。