原位杂交技术基本原理

原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放6射性或非放6射性的外源核酸(即探针)与***、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在***、细胞或染色体上的位置显示出来。

为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：***、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物。

杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性，较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4M的Na离子浓度，对Tm值、双链复性速率的影响不大，但随着Na离子浓度的降低，将显著影响Tm值和双链复性速率。

有2机溶2剂（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等双链体的解链温度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+ 90~100℃的条件下变性，那么应用于原位杂交，样品必须在65~75℃的条件下进行长时间变性，这将导致样品形态学的***。50%甲酰胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。

***葡聚糖具有很强的水合性，高浓度的***葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境，增加了探针浓度，加快杂交反应速率。

杂交技术***重要的因素之一是选择***适的杂交反应温度。若反应温度低于Tm 10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。通常有三种温度可供试验，即***适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的影响见表18-3。

***适复性温度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm –25℃

苛刻复性温度：Ts = Tm – (10或15℃)

非苛刻复性温度：Tns =Tm – (30或35℃)

根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。在大多数情况下，可以选择克0隆的DNA或cDNA双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。例如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克0隆人M13噬菌体DNA获得）或RNA探针，寡核苷酸探针也可。长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体 ，但不适宜于***原位杂交，因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。在这种情况下，寡核苷酸探针和短的PCR标记探针（80～150bp）具有较大的优越性。