(1)75% (体积分数)酒精消毒孕鼠,在无菌条件下取出胎鼠,分离并切取脊髓,置于冷的无钙、镁的HBSS液的平皿中( 下置冰袋)。
(2)解剖显微镜无菌条件下仔细剥离脊膜及血管。
(3)用弹簧剪将脊髓剪成1cm3大小,消化液37℃消化15-20min,每五分钟振荡一次;
(4)去掉上清,加入终止液终止消化,吹打10-15次,不能有气泡,收集上清,剩余***再消化一次。
(5)4℃1000rpm离心10min,弃上清,加入种植液1重悬,培养箱内差速贴壁30min;
(6)收集上清,台盼蓝染色计数,按6*105cells/孔种入六孔板(种植液1),37℃,5%CO2,95%饱和湿度的培养箱中培养;
(7)培养第二天,全换液更换为种植液2;
(8)培养第四天,半量换液加入5uM的,24h全量换液;
(9)之后每周换液两次。
动物实验检测技术在动物疫病防控中的作用
在国内动物疫病检测中,检测人员需要预先在实验室内将动物的产品及动物有关物品开展检查、检测,并根据实际的检测结果,开展动物疫病的防控,并建立科学完善的防控体系。疫病防控单位需要组建实验室,并为实验室配备的检测仪器,配备的检测人员,进而提高实验室的检测能力和检测水平。
原位杂交涉及的步骤:玻片的准备和样品固定,细胞或***的预渗透处理,靶DNA变性(DNA原位杂交),探针制备,原位杂交过程,杂交后洗涤,探针(显色)检测。
玻片的准备和样品固定
对于染色体涂片,1:1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于***切片的原位杂交,为了在实验过程中不丢失***样品,可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。
样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中的步骤,从化学反应角度来看,固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大,因为核酸杂交的功能分子基团被安全地包裹在DNA双螺旋结构中,而交联剂的使用对RNA基本没有影响。对于染色体涂片,常使用/固定;石蜡包埋的***切片用固定。冷冻切片可通过在4%的甲醛溶液中固定30min,或使用Bouin固定剂。
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