实验小鼠血浆取材要求

　　血液必须在采血时或采血后立即与剂充分混合。采血时与抗凝剂混合方法：用于血液收集的无菌1mL可以将1mL剂从小瓶吸入，然后将全部剂重新注回小瓶，即在采血前用剂“灌注”采血的。采血后与抗凝剂混合方法：向1.5mL离心管中加入不超过150μL的抗凝剂。在相对离心力14000g下离心血样10-15分。用移液管吸取分离的血浆，并转移到干净的离心管中。可将血浆样本在14000g下再离心2-3分钟，以分离任何剩余的红细胞。将分离好的血浆转移到干净的离心管中。

(1)75% (体积分数)酒精消毒孕鼠,在无菌条件下取出胎鼠,分离并切取脊髓,置于冷的无钙、镁的HBSS液的平皿中( 下置冰袋)。

(2)解剖显微镜无菌条件下仔细剥离脊膜及血管。

(3)用弹簧剪将脊髓剪成1cm3大小，消化液37℃消化15-20min，每五分钟振荡一次；

(4)去掉上清，加入终止液终止消化，吹打10-15次，不能有气泡，收集上清，剩余***再消化一次。

(5)4℃1000rpm离心10min，弃上清，加入种植液1重悬，培养箱内差速贴壁30min；

(6)收集上清，台盼蓝染色计数，按6*105cells/孔种入六孔板（种植液1），37℃，5%CO2，95%饱和湿度的培养箱中培养；

(7)培养第二天，全换液更换为种植液2；

(8)培养第四天，半量换液加入5uM的，24h全量换液；

(9)之后每周换液两次。

肝纤维化动物模型法：

180～200g Wistar或SD大鼠，皮射40%-50%CCl4，油溶液(0.3ml/100g)，每周2次，第2周 始，隔日以20％-30％酒精lml灌胃(或作为饮料)，饲以单纯玉米面(混以0.5％胆固醇)，共10周。

评价：第2周出现小叶中心小片状肝细胞变性坏死， 第4周开始有较薄的纤维间隔形成，第6周间隔进一步增厚，有假小叶形成：第8周形成厚的纤维间隔，分割形成假小叶。大鼠成活率60%-80%。

该模型是目前国内外常采用的动物模型，可靠且时间短，肝纤维化进展稳定，适合于过程的动态研究。