样品预处理

　　在待测样品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹缠绕，根据不同的细胞和***样品的应用，可选择合适的预处理方法将靶核酸暴露：

　　内源性酶灭活：如果探针的检测是通过酶促法进行的，则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的POD可通过含1%H2O2的甲醛溶液处理30min。如果检测酶为AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP检测的内源性背景一般来说比POD检测的低得多，因为在杂交过程中，样品中内源性AP酶的活性基本都丧失了。

　　RNase处理：在DNA-DNA杂交实验中，RNase的处理可去除内源性RNA，增加实验的信噪比。在进行mRNA为靶标的检测时，RNase处理的样品也可作为质控对照。通常的处理方式是将DNase-free的RNase溶解于2×***(100μg/ml)，样品在溶液中37℃处理60min。

　***=150mMN***,15mM柠檬酸钠溶液(pH7.4)

　　HCl处理：对样本进行20-30min的200mMHCl处理，可将蛋白抽提，并将核酸序列进行一定程度的水解，增加杂交检测的信噪比。

　　去垢剂处理：如果对样品的固定、脱水、包埋等预处理过程不足以将脂膜成分***暴露核酸，可对样品进行额外的蛋白去垢剂处理(如TritonX-100和SDS)。

　　蛋白酶处理：样品中待杂交的核酸序列常与蛋白缠绕交联在一起，样品的固定步骤更是加剧了蛋白的交联程度，因此预渗透是核酸杂交前的常规步骤，通常通过蛋白酶K的消化作用来完成。根据不同的文献来源，蛋白酶K的工作浓度通常设为10-500μg/ml(溶解于20mMTris-HCl,2mMC***2,pH7.4,酶浓度可根据具体样品进一步优化)，对样品进行37°C7.5–30min的处理。染色体涂片或核片的蛋白酶K处理浓度可降至1μg/ml消化7.5min。也有文献指出，固定石蜡包埋的***切片样品，使用胃蛋白酶（500μg/ml，溶于200mMHCl）将得到较好的蛋白消化结果。

原位杂交过程

　　杂交前可进行预杂交，以防止较高的背景染色。预杂交条件与杂交条件相同，只是预杂交液中不含探针和***葡聚糖。

　　靶DNA的变性（对mRNA的原位杂交无需此步）

　　样品DNA的变性在DNA-DNA杂交检测中是必须的步骤，但同时可能会造成样品形态学的部分***，此步是实验中需要优化的一个步骤。常用的变性方法为碱变性和热变性，实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得佳条件。

　　如使用热变性方法，可在杂交时将探针的变性和样品DNA变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱80℃变性，染色体DNA样品处理2min，后冷却至37℃进行杂交。***样品DNA的变性时间可增加至80℃10min。