***元原代培养是将胚胎哺乳动物***系统的部分***，如大脑皮层、海马、脊髓等脑***直接取出，再接种培养的方法。目前国内、外有关***元培养的方法较多，但在原代培养中***元的纯度和产量方面还存在一些急待解决的问题。由于***元是一种高度分化的细胞，相对于其它细胞而言，***元在体外更难以存活和生长。因此，体外培养***元要求的培养方法和营养条件均较为特殊。

***细胞的体外培养技术是研究***源性***的发病机制、进程的一个重要工具，能很好的、直观的反映离体***元的发育状况和生理活性，如何建立一个稳定成熟的***细胞培养体系是***系统***体外实验研究顺利进行的基础。随着基础***及临床***研究的逐渐深入，***细胞的体外培养技术在脑损伤、******、***相关******方面得到广泛重视和普及应用。

(1)75% (体积分数)酒精消毒孕鼠,在无菌条件下取出胎鼠,分离并切取脊髓,置于冷的无钙、镁的HBSS液的平皿中( 下置冰袋)。

(2)解剖显微镜无菌条件下仔细剥离脊膜及血管。

(3)用弹簧剪将脊髓剪成1cm3大小，消化液37℃消化15-20min，每五分钟振荡一次；

(4)去掉上清，加入终止液终止消化，吹打10-15次，不能有气泡，收集上清，剩余***再消化一次。

(5)4℃1000rpm离心10min，弃上清，加入种植液1重悬，培养箱内差速贴壁30min；

(6)收集上清，台盼蓝染色计数，按6*105cells/孔种入六孔板（种植液1），37℃，5%CO2，95%饱和湿度的培养箱中培养；

(7)培养第二天，全换液更换为种植液2；

(8)培养第四天，半量换液加入5uM的，24h全量换液；

(9)之后每周换液两次。

原位杂交过程

　　杂交前可进行预杂交，以防止较高的背景染色。预杂交条件与杂交条件相同，只是预杂交液中不含探针和***葡聚糖。

　　靶DNA的变性（对mRNA的原位杂交无需此步）

　　样品DNA的变性在DNA-DNA杂交检测中是必须的步骤，但同时可能会造成样品形态学的部分***，此步是实验中需要优化的一个步骤。常用的变性方法为碱变性和热变性，实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得佳条件。

　　如使用热变性方法，可在杂交时将探针的变性和样品DNA变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱80℃变性，染色体DNA样品处理2min，后冷却至37℃进行杂交。***样品DNA的变性时间可增加至80℃10min。