原位杂交试验

收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲6醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲9醇，在-20C 保存，待用(两天和两天以上的胚胎需要用双氧6水处理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成)

原位杂交是指；分子杂交的一种形式。由未经抽提分离的染色体DNA，在原来位置上被变性成单链后，与探针进行分子杂交。1977年由本顿(W.D.Benton)和戴维斯(R.W.D***is)在原分子杂交基础上发展的一种较新的分子杂交技术。方法是将菌落或噬菌斑转移到硝9酸纤维素滤膜上，使在原位发生溶菌后变性的DNA，同滤膜原位结合，再与有放5射性同位素标记的特定核苷酸“探针”杂交，其结果可用放5射自显影来显示，出现银粒的地方便是待测染色体DNA上与探针互补顺序所在的位置。对快速检测转化群落中的DNA序列或任何一种插入的DNA序列，以及动植物的******工作，都具有广泛应用价值。(见“分子杂交”、“放5射自显影”、“影印培养技术”)

多种探针标记检测系统

基于地高3辛、生物素和荧光标记分子的标记和检测系统是常见的原位杂交检测方法。

荧光标记检测常为直接探针标记方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上连接Fluorescein后进行核酸标记。由于标记在核酸上的荧光分子必须经受杂交和洗脱过程中的考验，以及荧光分子易于衰减，其检测灵敏度受到一定的影响。但对荧光分子的直接检测呈现的背景较低。

杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性，较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4M的Na离子浓度，对Tm值、双链复性速率的影响不大，但随着Na离子浓度的降低，将显著影响Tm值和双链复性速率。

有2机溶2剂（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等双链体的解链温度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+ 90~100℃的条件下变性，那么应用于原位杂交，样品必须在65~75℃的条件下进行长时间变性，这将导致样品形态学的***。50%甲酰胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。

***葡聚糖具有很强的水合性，高浓度的***葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境，增加了探针浓度，加快杂交反应速率。