原位杂交中探针的选择

DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。寡核苷酸探针的长度较短，因此避免了探针内部退火的问题，在杂交时的渗透能力也更好，探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。DNA探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度，通常300-1000bp左右，能覆盖到较长片段的靶核酸序列，增加检测的灵敏度。

原位杂交 (ISH) 是用于***固定***和细胞中特定核酸靶标的强大技术，能够获得与***表达和遗传位点相关的时间和空间信息。 虽然ISH的基本工作流程与印迹杂交近似，即核酸探针被合成、标记、纯化和特异性靶标退火，但其不同之处在于前者可通过可视化显示***内的结果来获得更多信息。 如今有两种基本方法来实现可视化显示原位RNA和DNA靶标，即荧光 (FISH) 和显色 (CISH) 检测。 每种检测方法本身的特点（见下表）使得FISH和CISH适用于截然不同的应用。 虽然两种方法均使用标记的、与样本杂交的靶标特异性探针，但每种方法用于可视化显示样本的仪器不同。 这里我们将强调每种方法的不同之处和各自的优势。

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在选用探针时经常会受到可利用探针种类的限制。如在建立DNA文库时，手头没有筛选特定***的克0隆探针，这时就可用寡核苷酸探针来代替。但必须首先纯化该***的编码蛋白，并测定6个以上的末端氨基酸序列，通过反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探针。如果已有其它动物的同种***克0隆，因为人类和动物间在同一***的核苷酸顺序上存在较高的同源性，因此可利用已鉴定的动物***作探针来筛选人类***克0隆。对于***核苷酸序列背景清楚而无法获得克0隆探针时，可采用PCR方法扩增某段***序列，并克0隆人合适的质粒载体中，即可得到自己的探针。这种方法十分简便，无论***组DNA探针还是cDNA探针都可以容易地获得，而且，可以建立PCR的***检测方法，与探针杂交方法可作对比，可谓一举两得。