原位杂交中探针的选择

DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。寡核苷酸探针的长度较短，因此避免了探针内部退火的问题，在杂交时的渗透能力也更好，探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。DNA探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度，通常300-1000bp左右，能覆盖到较长片段的靶核酸序列，增加检测的灵敏度。

杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性，较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4M的Na离子浓度，对Tm值、双链复性速率的影响不大，但随着Na离子浓度的降低，将显著影响Tm值和双链复性速率。

有2机溶2剂（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等双链体的解链温度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+ 90~100℃的条件下变性，那么应用于原位杂交，样品必须在65~75℃的条件下进行长时间变性，这将导致样品形态学的***。50%甲酰胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。

***葡聚糖具有很强的水合性，高浓度的***葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境，增加了探针浓度，加快杂交反应速率。

原位杂交 (ISH) 是用于***固定***和细胞中特定核酸靶标的强大技术，能够获得与***表达和遗传位点相关的时间和空间信息。 虽然ISH的基本工作流程与印迹杂交近似，即核酸探针被合成、标记、纯化和特异性靶标退火，但其不同之处在于前者可通过可视化显示***内的结果来获得更多信息。 如今有两种基本方法来实现可视化显示原位RNA和DNA靶标，即荧光 (FISH) 和显色 (CISH) 检测。 每种检测方法本身的特点（见下表）使得FISH和CISH适用于截然不同的应用。 虽然两种方法均使用标记的、与样本杂交的靶标特异性探针，但每种方法用于可视化显示样本的仪器不同。 这里我们将强调每种方法的不同之处和各自的优势。

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